煙草套作對土壤微生物群落多樣性的影響

賀國強，趙冬雪，李恒全，李松梅，魏秀梅，蔡興宏，敖紅*

(1.牡丹江煙草科學研究所，黑龍江 哈爾濱 150076； 2.東北林業大學 生命學院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.牡丹江煙葉公司 東寧分公司，黑龍江 東寧 157299； 4.哈爾濱煙葉公司 賓縣分公司，黑龍江 賓縣 150400；5.牡丹江煙葉公司，黑龍江 牡丹江 150711)

套作作為一種新型農業栽培模式，在調整農業產業結構、提高經濟效益等方面的作用已得到廣泛認可[1]。套作可爭取時間提高光能和土地利用率，有利于后作的適時播種和栽植，而且能有效提高農田生態系統的生物多樣性[2]。目前，農業套作的研究重點已逐漸由地上部分的相互作用向地下部分的相互作用轉移，尤其是套作物種根系間和根際微生物間的相互作用[3-4]。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成成分，土壤的物質和能量循環轉化均在不同微生物的作用下完成[5-7]。微生物群落結構與微生物群落多樣性對土壤可持續利用有重要作用，可作為指示土壤質量和評價土壤肥力的重要指標[8]。目前，關于植煙土壤微生物方面的研究多集中在酶活性、微生物量碳、土壤細菌數量等方面[9-10]，關于植煙土壤微生物群落功能的研究較少。土壤微生物群落功能多樣性的研究方法有很多，其中，Biolog微孔板是能夠較敏感地反映微生物群落功能的一種鑒定方法，它通過對單一碳源的利用測定反映微生物群體水平的情況，以此來表征微生物群落功能多樣性。本研究采用Biolog微孔板技術對牡丹江市煙草科學研究所試驗田套作紫花苜蓿或小麥的煙草團棵期、成熟期的土壤微生物碳代謝能力進行研究，旨在揭示煙草套作對植煙土壤微生物多樣性的影響，為煙草套作模式開發提供一定的參考和依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地設在牡丹江市煙草科學研究所試驗田。試驗田地處寒帶東部，128°02′～131°18′E、43°24′～45°59′N。全年日照時數約2 400 h，年平均氣溫6.1 ℃，年均無霜期140 d，年均降水量580 mm。供試土壤為暗棕土。試驗地塊土壤肥力均勻一致，土壤質地為黏壤，土壤類型為河淤土，土壤pH為7.2，碳、氮、硫含量分別為13.7、2.6、0.7 g·kg-1，有機質含量為23.1 g·kg-1，水解性氮含量為89.55 mg·kg-1，有效磷含量為21.59 mg·kg-1，速效鉀含量為165.45 mg·kg-1。

1.2 處理設計

供試煙草品種為龍江911，與小麥(TriticumaestivumL.)或紫花苜蓿(MedicagosativaL.)套作。上述試驗材料均由黑龍江省牡丹江市煙草科學研究所提供。

于2016年開展定位試驗，共3個處理：處理1，烤煙與紫花苜蓿套作；處理2，烤煙與小麥套作；處理3，不套作對照(CK)。隨機區組設計，每處理重復3次，行長6 m、壟距1.1 m，每小區面積59.4 m2。烤煙5月移栽，小麥、紫花苜蓿7月下旬播種。烤煙采收結束后，清理煙稈。2016年11月初翻耕小麥秸稈和紫花苜蓿，2017年4月起壟，5月再次移栽烤煙。

1.3 土壤樣品采集

于 2017年6月(團棵期)、10月(成熟期)按5點取樣法選取植株，去掉表層土壤，用鐵鏟垂直向下挖取0～20 cm土壤。剔除土壤樣品中的雜物，裝人無菌的封口袋密封，置于冰盒內帶回實驗室。土壤樣品研磨過篩，放入4 ℃冰箱，用于Biolog-Eco微平板和土壤微生物量碳、氮的測定。

1.4 研究方法

用包含31種碳源的Biolog-Eco微平板對植煙土壤進行微生物群落功能多樣性分析。將土壤樣品在25 ℃下活化24 h，稱取相當于10 g烘干土重的鮮土加入90 mL滅菌NaCl溶液中，加無菌封口膜封口。將樣品在渦旋振蕩器上振蕩1 min，然后置于冰水浴中1 min，反復3次；靜置2 min后稀釋，逐漸稀釋為10-2和10-3的懸浮液。用移液器向微平板上每孔中加人150 μL的10-3的土壤懸浮液，然后，將微孔板置于25 ℃培養箱內連續培養，分別在0、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264 h用酶標儀(sunrise remote，TECAN)測定590 nm處吸光值。

稱取3份相當于10.0 g干土的鮮土分別放入25 mL小燒杯中。將盛有鮮土的燒杯置于真空干燥器中，并放置盛有無水乙醇氯仿(約2/3體積)的15 mL燒杯2只，燒杯內放入防暴沸玻璃珠。同時，放入一盛有NaOH溶液的小燒杯，用于吸收熏蒸過程中釋放出來的CO2，干燥器底部加入少量水。蓋上真空干燥器蓋子，用真空泵抽真空，使氯仿沸騰5 min。關閉真空干燥器閥門，于25 ℃黑暗條件下培養24 h。熏蒸結束后，打開真空干燥器閥門，取出盛有氯仿和稀NaOH溶液的小燒杯，反復抽真空5次，每次3 min，直到土壤無氯仿味道為止。同時，另稱等量的3份土壤，置于另一干燥器中作為不熏蒸對照處理。從干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土樣，將土樣完全轉移至80 mL聚乙烯離心管中，加入40 mL 0.5 mol·L-1硫酸鉀溶液，300 r·min-1振蕩30 min，用濾器過濾。使用multi N/C 2100s TOC分析儀(Analytik Jena，德國)測定土壤微生物量碳、氮。

1.5 數據處理

計算平均顏色變化率(AWCD)，該指標能夠表示微生物的代謝強度和對單一碳源的利用能力：

式中：RAWCD為計算得到的AWCD值；Fi為所測定的第i個碳源孔的光密度值，R為對照孔的光密度值，(Fi-R)為負值時則歸0。采用Biolog微平板培養96 h的數據進行統計，此時，大部分微生物均已參與碳源的代謝過程，因此，能較全面地描述微生物群落輪廓。

采用Shannon指數(H)、Simpson指數(D)和Mclntosh指數(U)來描述土壤微生物群落代謝的功能多樣性：

H=-∑[Ki×ln(Ki)]；

D=1-∑Ki2；

式中，Ki為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比率，ni是第i孔的相對吸光值。

根據熏蒸土壤與未熏蒸土壤測定有機碳、氮的差值和轉換系數(KEC)，從而計算土壤微生物生物量碳、氮。

使用Excel 2003進行數據整理，采用SPSS 19.0進行單因素方差分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物利用碳源的動力學特征

AWCD可以反映土壤微生物群落對碳源的利用程度，表征土壤中微生物的代謝活性。如圖1所示，隨著培養時間延長，土壤微生物群落對碳源的利用總量先逐漸增長后漸趨平緩。在0～96 h，各處理的AWCD快速增長，說明土壤微生物對碳源的代謝活性極強，且各處理團棵期的AWCD值顯著高于成熟期。在96～192 h，AWCD緩慢增加至趨于穩定。其中，團棵期、成熟期均以處理1的AWCD值較高，在整個培養過程中土壤微生物碳代謝活性最強，而CK處理的顯著低于2個套作處理，說明套作增強了土壤微生物群落對碳源代謝的能力。

Ⅰ—處理1-團棵期；Ⅱ—處理2-團棵期；Ⅲ—處理3-團棵期；Ⅳ—處理1-成熟期；Ⅴ—處理2-成熟期；Ⅵ—處理3-成熟期。圖2～3同。圖1 土壤微生物群落隨著培養時間的變化

2.2 土壤微生物群落多樣性分析

根據培養96 h獲得的微生物AWCD值，計算Shannon指數(H)、Simpson指數(D)和Mclntosh指數(U)(表1)。結果顯示，不同處理在各項土壤微生物群落多樣性指數上存在顯著差異。兩個套作處理的土壤微生物培養96 h的AWCD值在團棵期和成熟期均顯著高于對照，說明套作土壤的微生物代謝活性更強。Shannon指數表示土壤中微生物群落的物種豐富度，其值越高，說明土壤微生物種類越多。團棵期，處理1和處理2的Shannon指數差異不顯著，但均顯著高于對照；成熟期，處理1的Shannon指數顯著高于處理2，且兩者均顯著高于對照，說明套作能顯著提高土壤微生物的群落豐富度，且以套作紫花苜蓿的效果更好。Simpson指數表示常見物種的優勢度，Mclntosh指數表示土壤微生物群落物種的均勻度。套作處理的土壤微生物Simpson指數和Mclntosh指數顯著高于對照。

表1 培養96 h的土壤微生物群落AWCD和多樣性指數

注：同列數據后無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.3 土壤微生物對6大類碳源的利用強度

Biolog-Eco微平板上31種碳源分屬于氨/胺類、氨基酸類、羧酸類、其他化合物類、聚合物類和糖類。不同處理各時期土壤微生物群落對不同碳源的利用程度如圖2所示。可以看出，不同處理不同生長時期土壤微生物對氨基酸類、羧酸類和糖類的利用程度高于氨/胺類、其他化合物類和聚合物類。團棵期土壤微生物對氨基酸類、羧酸類、其他化合物類和糖類的利用程度顯著高于成熟期。成熟期對照處理土壤微生物群落對其他化合物類和糖類的利用程度最低，且顯著低于其他處理對其他化合物類和糖類的利用程度。

相同碳源柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖2 不同處理土壤微生物對不同碳源的利用水平

2.4 土壤微生物對碳源利用多樣性的主成分分析

主成分分析方法是將不同樣本的多元變量重新組合成一組新的互相無關的綜合變量，并盡可能多地反映原來變量信息的統計方法。在空間中，點的位置可以直觀地反映不同處理的土壤微生物群落的代謝特征，并解釋微生物對碳源利用的多樣性。從表2可以看出，應用主成分分析方法在31種碳源中提取了3個主成分因子(PC1～PC3)，分別可以解釋變量方差的46.5%、15.2%、10.2%，主成分1、2、3的累計貢獻率達72.0%，能解釋變量的絕大部分信息。

表2 主成分的貢獻率和累計貢獻率

由圖3可知：在PC1軸上，團棵期各處理主要分布在正方向上，處理1的得分系數為8.69～8.23，處理2的得分系數為7.89～8.08，對照的得分系數為3.26～4.12；成熟期各處理主要分布在負方向上，得分系數集中在-2.38～-1.11。在PC2軸上，團棵期，處理1位于正方向上，其他處理均位于負方向上，得分系數分別為-5.02～-2.50和-1.27～-0.45；成熟期，各處理集中分布在PC2軸原點附近。不同生長時期和不同處理在PC軸上呈現出不同的空間分布，說明不同生長時期和不同套作模式下土壤微生物對碳源的利用種類和程度存在明顯差異。

圖3 不同處理土壤微生物群落利用碳源的主成分分析結果

初始載荷因子反映主成分與碳源利用的關系，載荷因子高表示該碳源對主成分的影響較大。從表3可以看出，載荷因子大于0.85、表現出與主成分1顯著相關的碳源包括：糖類2種、其他化合物類2種、羧酸類1種、氨基酸類1種，與主成分2顯著相關的碳源僅羧酸類1種。由此可知，糖類、其他化合物類和羧酸類碳源是引起土壤微生物群落代謝差異的主要碳源類型。

表3 31種碳源的主成分載荷因子

2.5 不同處理對土壤微生物量碳、氮的影響

土壤微生物量碳、氮是土壤碳素和氮素養分轉化和循環研究中的重要參數，能直觀地反映土壤微生物和土壤肥力水平，在土壤肥力和植物營養供應中具有重要作用。從表4可以看出，在團棵期和成熟期，2個套作處理的土壤微生物量碳、氮含量均高于對照。

表4 不同處理對土壤微生物量碳、氮含量的影響

3 討論

本研究中，不同生長時期、不同套作模式的土壤微生物對碳源總量的利用呈現出與其他微生物培養一致的規律，均包括極速上升期、緩慢上升期、穩定期等生長階段。土壤微生物群落 AWCD 隨時間的變化可以反映植煙土壤微生物群落的活性，較直觀地反映微生物群落的反應速度，及對碳源利用的程度，其值越高，表征土壤微生物群落代謝活性越強。本研究中，2個生長時期(團棵期和成熟期)的土壤微生物群落AWCD均表現為套作處理的顯著高于對照，且在培養過程中，套作紫花苜蓿的AWCD高于套作小麥的。不同生長時期不同套作模式下土壤微生物在微平板上的AWCD和微生物代謝多樣性指數與對照處理相比差異較大，說明套作對土壤微生物有顯著影響[11]。王修忠等[12]的研究表明，煙田后期套作綠肥是南方煙稻復種區可行的綠肥種植模式之一，是控制上部煙葉煙堿含量和提高上部煙葉可用性，以及優化煙草土壤質量的有效途徑。對照處理降低了土壤AWCD和微生物多樣性指數，說明連作降低了微生物多樣性，會影響土壤養分的可持續性發展，在生產中應盡量避免連作[13-14]。土壤微生物的Shannon指數、Simpson指數和Mclntosh指數可以表征土壤微生物群落的多樣性，能反映土壤微生物群落結構和功能的差異[11,15]。本研究中，套作處理與對照相比顯著提高了土壤微生物群落的豐富度、均勻度、優勢度，說明套作能提高植煙土壤的優勢菌群。這可能是因為土壤微生物群落不僅受到植煙根系分泌物的影響[16]，而且還受到套作作物殘茬還田對土壤養分的影響。植物根系及其殘體向土壤中分泌大量有機物質，套作模式下植煙土壤有機質含量和組成的變化可能是影響土壤微生物碳代謝的重要原因[17]。另外，由于根系分泌物具有黏附作用[18]，套作還可以改善土壤孔隙度和土壤團粒結構，促進微生物菌群的增殖，使土壤微生物群落結構發生改變。

主成分分析結果表明，不同生長時期不同套作模式的土壤微生物群落功能多樣性差異顯著：與主成分1顯著相關的碳源有6種，主要為糖類、其他化合物類，其次是氨基酸類、羧酸類；與主成分2顯著相關的碳源有1種，是羧酸類。其中，比較敏感的碳源類型主要為糖類、其他化合物類和羧酸類[19]。有研究表明，土壤微生物群落在煙草栽培過程中會發生變化。有關作物輪作和休耕的研究表明，一般適合輪作的栽培作物包括禾本科和豆科植物[20-21]。本試驗中，小麥為禾本科植物，紫花苜蓿為豆科植物。紫花苜蓿與小麥相比，對氮的固持能力更強，更有利于提高土壤C/N，便于微生物對土壤中過量的氮素進行固定，從而提高土壤的氮素供應能力，為微生物的繁殖提供充足氮源，進而改變土壤微生物群落結構[22]。

土地的利用方式對土壤微生物群落組成有重要影響[23]，時間變化也會改變土壤微生物群落的組成[24]。本試驗中，團棵期與成熟期相比，土壤微生物對碳源的利用能力提升，利用種類增多。可能原因是，團棵期適宜的土壤溫、濕度為微生物生長、繁殖和代謝提供了良好的代謝環境[25]；成熟期，較低的土壤溫、濕度抑制了土壤微生物的生長，微生物的代謝能力減弱，土壤微生物的活性降低。同時，不同時期，腐解速度、田間持水量等因素的影響也不同，也可能是引起土壤微生物群落結構和功能多樣性變化的原因[26]。

總體來看，合適的套作模式能提高植煙土壤的微生物群落多樣性，顯著提升微生物群落對Biolog微平板中碳源的利用能力。套作對植煙土壤微生物有顯著影響，且套作紫花苜蓿對土壤微生物的影響優于套作小麥。綜合來看，植煙套作建議選用豆科植物。植煙連作會降低土壤微生物的多樣性和土壤微生物群落對碳源的利用能力，套作綠肥是一種更有效的煙草種植模式。