外源激素對臺閩苣苔葉片分化及再生的影響

付雙彬，池夢薇，楊燕萍，姚麗娟，周莊*

(1.浙江省農業(yè)科學院亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005； 2.福建農林大學 園林學院，福建 福州 350002)

苦苣苔科植物種類繁多，全世界約有140屬，2 000余種，我國有58屬463種。苦苣苔科植物中許多具有極高的觀賞價值和藥用價值[1-2]，其中臺閩苣苔(Titanotrichumoldhamii(Hemsl.) Soler.)隸屬于臺閩苣苔屬，為苦苣苔科單屬單種植物，是我國的特有種，分布范圍狹窄，特產于浙江、福建和臺灣，屬瀕危稀有種，由于其在苦苣苔科系統(tǒng)中的特殊位置，其研究和開發(fā)具有重要意義[2-3]。

對于瀕危的重要植物，基于組織培養(yǎng)的繁殖和離體保存是現(xiàn)今較為有效的方法[4]，通過組織培養(yǎng)的方法，可以使用少量的植物材料，在短期內繁殖大量的優(yōu)質幼苗，從而用于研究和保護。現(xiàn)今已有許多苦苣苔屬植物組織培養(yǎng)的報道[5-6]，而對于臺閩苣苔的組培研究不多，存在一些激素的作用以及愈傷組織、不定芽誘導分化的效率不高等現(xiàn)象[2-3]，因此，本文以臺閩苣苔無菌苗的葉片為材料，研究了生長素2,4-D、NAA，細胞分裂素6-BA、TDZ、KT不同濃度以及組合對于臺閩苣苔無菌苗葉片分化再生的影響，以期為臺閩苣苔的組培繁殖提供更詳盡的補充，為臺閩苣苔的保護和開發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為臺閩苣苔無菌苗，接種時將整個葉片剪下，近軸面朝上直接接在培養(yǎng)基上。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

以MS[6]為基本培養(yǎng)基，添加白砂糖30 g·L-1，瓊脂7.5 g·L-1，調pH至5.8，于121 ℃滅菌30 min。外植體接種后在溫度(25±2)℃、光照強度2 000 lx、光照時間16 h·d-1的條件下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 NAA和6-BA不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

添加NAA和6-BA濃度分別為0、0.2、0.4、0.8、1.2 mg·L-1，對兩種激素進行完全隨機的組合試驗，每瓶接種5個葉片，重復5次。在第30天統(tǒng)計不定芽誘導率、愈傷誘導率和死亡率，在第120天統(tǒng)計記錄最終生長情況。

1.3.2 NAA和TDZ不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

添加TDZ濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，對兩種激素進行完全隨機的組合試驗，每瓶接種5個葉片，重復5次。在第30天統(tǒng)計不定芽誘導率、愈傷誘導率和死亡率，在第120天統(tǒng)計記錄最終生長情況。

1.3.3 NAA和KT不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

添加KT濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，NAA 0、0.1 mg·L-1，對兩種激素進行完全隨機的組合試驗，每瓶接種5個葉片，重復5次。在第30天統(tǒng)計不定芽誘導率、愈傷誘導率和死亡率，在第120天統(tǒng)計記錄最終生長情況。

1.3.4 2,4-D和6-BA不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

添加2,4-D濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 mg·L-1，6-BA 0、0.1 mg·L-1，對兩種激素進行完全隨機的組合試驗，每瓶接種5個葉片，重復5次。在第30天統(tǒng)計不定芽誘導率、愈傷誘導率和死亡率，在第120天統(tǒng)計記錄最終生長情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

不定芽和愈傷數(shù)(量)從高到低依次記為極多(大)、多(大)、少(小)；葉根完整，株高5 cm以上記為完整植株。

不定芽誘導率/%=誘導出不定芽的葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100；愈傷誘導率/%=誘導出愈傷的葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100；死亡率/%=死亡葉片數(shù)/葉片接種數(shù)×100。圖表用Microsoft Excel 2016繪制，數(shù)據(jù)用平均值加減標準差表示，方差分析和多重比較(LSD)需將數(shù)據(jù)進行反正弦轉換后進行，分析軟件采用SPSS 22.0。

2 結果與分析

2.1 NAA和6-BA不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

由表1可以看出，在所有處理中，除6-BA為1.2 mg·L-1，NAA為0.2～1.2 mg·L-1時，其它均能100%誘導產生不定芽，這些不定芽未經過愈傷組織而直接產生，并且數(shù)量極多，后期通過增殖、生根等可再生為植株[2-3]。單獨來看，在不添加任何激素的培養(yǎng)基中，葉片能直接分化再生植株，并且會有少量根產生，但植株多而不壯，根少而不強，直接移栽不易成活，但可通過生根培養(yǎng)基進行再生根壯苗提高移栽存活率(圖1中A、B)。在只添加NAA的培養(yǎng)基先期產生一定量的不定根，后期全部為愈傷組織，其中摻雜少許不定芽(圖1中C、D)，并且這些愈傷在新培養(yǎng)基中能夠增殖，轉入不含激素的培養(yǎng)基中可分化出不定芽(圖1中E)。在添加6-BA的培養(yǎng)基中誘導出大量不定芽(圖1中F)，其中，在只添加6-BA的培養(yǎng)基中，一些不定芽在后期可直接再生成植株，這些植株同樣多而不壯；而在同時添加NAA和6-BA的培養(yǎng)基中，后期又會產生少量愈傷組織，但不會有植株產生(圖1中G)。

表1 NAA和6-BA不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

2.2 NAA和TDZ不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

如表2所示，所有的組合中都有不定芽產生，其中以TDZ 0.5、3.0 mg·L-1中不定芽誘導率最高，與1.0～2.0 mg·L-1TDZ，2.0～3.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA的處理差異不顯著，并且這些產生的不定芽數(shù)量極多；在單獨添加TDZ的培養(yǎng)基中，所有處理都能誘導出愈傷組織，其中以TDZ 3.0 mg·L-1誘導率最高，這些愈傷組織量相對NAA誘導量較少，顏色呈深綠色，表面呈顆粒狀，其出現(xiàn)往往在產生不定芽之后(圖1中H)。

A—在未添加激素的培養(yǎng)基中獲得的再生植株；B—再生植株生根；C—在只含NAA的培養(yǎng)基中誘導的不定根；D—在只含NAA的培養(yǎng)基中誘導的愈傷；E—愈傷誘導不定芽；F—在NAA和6-BA組合下誘導的大量不定芽；G—NAA和6-BA組合誘導，后期不定芽和愈傷混合；H—TDZ誘導的愈傷；I—NAA和KT組合下誘導的不定根和不定芽；J—添加2,4-D誘導的愈傷。圖1 臺閩苦苣苔的分化再生

表2 NAA和TDZ不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

注：同列無相同小寫字母表示組間在5%水平上差異顯著。表3同。

此外，在TDZ 0.1～0.5 mg·L-1時，同時添加NAA的培養(yǎng)基中會產生少量完整植株。

2.3 NAA和KT不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

如表3所示，KT的作用與6-BA相同，主要誘導不定芽，但效果卻不如6-BA，并且無論低濃度或高濃度都有一定的死亡；其中以KT 1.0 mg·L-1、KT 1.0～2.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1不定芽誘導率最高，與KT 2.0 mg·L-1，處理差異不顯著，而添加有NAA的培養(yǎng)基中，與單獨添加NAA相似，先期誘導出一定量的不定根，呈不定芽和不定根混合的狀態(tài)，但無愈傷組織產生(圖1中I)。

2.4 2,4-D和6-BA不同濃度組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

在添加2,4-D的培養(yǎng)基中，在2,4-D為0.1和0.5 mg·L-1時，全部產生愈傷，并有少量不定芽產生，其他濃度均大部分死亡，這些愈傷組織與NAA和TDZ誘導的愈傷組織均不同，初始呈黃褐色(圖1、表4)，這些愈傷組織在新培養(yǎng)基中能夠增殖，轉入不含激素的培養(yǎng)基中也可分化出不定芽[3]。

表3 NAA和KT不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

表4 2,4-D和6-BA不同濃度及組合對于臺閩苣苔葉片分化的影響

3 小結與討論

植物生長調節(jié)劑是組培快繁的重要影響因子，不同種類、不同濃度的激素對于外植體的分化再生等都有重要的影響。在許多苦苣苔屬的植物組培過程中，不定芽的誘導一般采用較低濃度的細胞分裂素，較高的濃度會抑制不定芽的伸長，并會對后續(xù)的生根造成影響[3,7]。如湯正輝等[2]、Takagi等[3]在研究臺閩苣苔時，誘導不定芽分化培養(yǎng)基中6-BA都為0.1 mg·L-1，此外其他屬內植物如半蒴苦苣苔[8]、桂林小花苣苔[9]等也采用此濃度。在本文中單獨添加6-BA 0.2～0.8 mg·L-1時誘導出大量不定芽，而這些不定芽在后期可直接再生成植株，而附加一定濃度NAA同樣能誘導大量的不定芽，但不能自主再生成植株。當6-BA提高到1.2 mg·L-1時，葉片開始出現(xiàn)死亡，此時濃度是不適宜的。

同為細胞分裂素，KT的作用效果較6-BA要強[10]，但對于臺閩苣苔葉片外植體的誘導效果并不如6-BA，在較低濃度下才有比較好的效果，較高時外植體枯黃死亡率較高。同樣的，在非洲紫羅蘭的組培中，6-BA與NAA的搭配優(yōu)于KT與NAA的搭配[11]，此外其他研究者對比研究了在NAA濃度固定的前提下，與6-BA、KT、ZT和2,4-D 4種不同激素配合的誘導效果，結果均表明6-BA的誘導率最高[12]。

NAA、2,4-D在許多植物的組培中對愈傷組織的誘導起重要作用[10]，如苦苣苔屬植物大巖桐愈傷組織的形成最佳激素組合為2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1[13]，而在臺閩苣苔中添加0.1 mg·L-12,4-D即可誘導出大量愈傷組織，但2,4-D的量要嚴格控制，過高可能會導致外植體死亡，并且對不定根的誘導是不利的[14]。NAA有誘導不定根的效力，這在單獨添加NAA和KT、NAA的組合中體現(xiàn)較明顯，在單獨添加NAA 0.2～1.2 mg·L-1時，先期產生一定量不定根，后期葉片外植體全部誘導出愈傷組織，而且質量也較2,4-D的高。

TDZ是一種效果很強的細胞分裂素，被認為具有生長素和分裂素雙重作用[15]，在許多植物的愈傷誘導過程中發(fā)揮了關鍵作用，在褐紋報春苣苔的組培研究中，添加2.0 mg·L-1TDZ+0.1 mg·L-1NAA適于愈傷誘導[16]；文弢等[17]在大苞短毛唇柱苣苔的不定芽誘導時，發(fā)現(xiàn)TDZ起主要作用，當濃度為0.5 mg·L-1有利于誘導率和不定芽數(shù)量的提高。在此文中TDZ單獨添加主要誘導愈傷組織的產生，同時附帶大量不定芽，往往愈傷組織出現(xiàn)在后；而在TDZ低濃度時添加NAA，會減少愈傷誘導效果，而向不定芽和再生植株的方向轉變。

臺閩苣苔葉片外植體不經切割，在不含激素或含0.2～0.8 mg·L-16-BA的MS上能直接再生成植株，雖然這些植株移栽成活率較低，但植株的完整性表明這些材料在后續(xù)研究中的潛在價值以及繼續(xù)研究的價值；此外，TDZ、NAA、2,4-D對于愈傷誘導的高質量、高效率為臺閩苣苔后續(xù)的保護和開發(fā)奠定了良好的基礎。