正交法優選木賊山奈素水解條件的研究

胡玲玲

(安康學院 化學化工學院，陜西 安康 725000)

木賊(Equisetumhiemale):木賊科(Equisetaceae)木賊屬多年生草本植物的干燥地上部分，又名千峰草、筆頭草、節骨草等,為較常用的中藥材，分布于中國東北、華北、西北、西南及湖南、河南、湖北[1～5]。迄今為止，木賊科植物已發現有30多種，而木賊是《中國藥典》2000年版收載的品種，也是現今木賊屬唯一被藥典載入的植物[6]。其味甘、苦，性平，主要作用于肺經、肝經。具有祛風散熱、明目眼睛、清除白內障的功效。常用于治療風熱感冒、紅眼病、白內障，迎風流淚等癥狀。據藥理研究表明，木賊還對心血管系統有很好的保護、修復作用[7]，能抗氧化、抗衰老[8、9]和保肝、鎮痛作用[8]，主要是因木賊中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮類化合物對于治療疾病起著很重要的作用。山奈素屬于黃酮醇類，與黃酮類化合物具有相同的母核，且在木賊中山奈素為主要成分，故本實驗可用山奈素作為指標性成分[9]。山奈素的系統命名為：3,5,7-三羥基-4、-甲氧基黃酮，結構式如圖1。

圖1 山奈素的結構式

目前，測定植物黃酮類化合物含量的主要檢測方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、雙波長薄層掃描法等方法[10]。由于紫外分光光度法具有準確、操作簡單的特點[10]，且正交優選水解條件的實驗測試數據多，沒必要使用太過復雜的儀器或設備輔助。故筆者實驗擬采用以山奈素為指標性成分，通過紫外分光光度法測定山奈素含量，以此來比較木賊山奈素的最佳水解條件。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

實驗所用主要儀器見表1。

1.2 試劑與樣品(表2)

表1 實驗儀器與設備

表2 實驗試劑與樣品

2 實驗方法與結果

2.1 山奈素標準溶液的制備

用分析天平精確稱取2.10 mg的山奈素對照品，加少量無水甲醇[9]溶解，轉移到25 mL的容量瓶中，甲醇加至刻度線，搖動使其混合均勻，既得山奈素標準溶液，其質量濃度為84 μg·mL-1，置冰箱中備用。

2.2 供試品溶液的制備

將木賊樣品粉碎，過40目篩，精密稱取0.75 g，共9份，分別放置于50 mL具塞的圓底燒瓶中，加入75%乙醇25 mL并進行稱重，連通球形冷凝管，用水浴鍋加熱回流，放冷后再次稱重，用75%的乙醇補足損耗的乙醇，搖勻過濾，量取濾液10 mL，加入濃鹽酸，進行水解。水解液水浴蒸干，殘渣加10 mL蒸餾水溶解后倒入60 mL分液漏斗中，用10 mL乙酸乙酯萃取，萃取3次，合并萃取液，水浴使乙酸乙酯蒸干，將剩余殘渣部分用甲醇溶解多次少量溶解并轉移至5 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得木賊山奈素供試品溶液[6]。

2.3 最大吸收波長的選擇和標準曲線繪制

2.3.1 最大吸收波長的選擇 分別精密量取質量濃度為84 μg·mL-1的山奈素標準溶液和山奈素供試品溶液各2 mL，甲醇溶液定容到5 mL的容量瓶中，得山奈素對照品溶液。打開L-5S紫外分光光度計，預熱30 min，取制得的山奈素對照品溶液，以無水甲醇為空白溶液調零，進行全波長掃描，根據山奈素對照品溶液的最大吸收波峰，確定測定山奈素供試品液的最大吸收波長[10～13]。由波長掃描得，不管是山奈素對照品溶液，還是木賊山奈素供試品溶液，都在波長365nm處有最大吸光度，呈現最大吸收峰，故選擇波長365 nm為實驗的測定波長。

2.3.2 標準曲線繪制 用移液管精密量取84 μg·mL-1的山奈素標準溶液0.20 mL，0.40 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.00 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用無水甲醇稀釋至刻度線，制得1.68 μg·mL-1，3.36μg·mL-1，5.04μg·mL-1，6.72 μg·mL-1，8.40 μg·mL-1系列濃度的山奈素對照品溶液。以甲醇作為空白對照[10～13]，在最大吸收波長下，用紫外分光光度計測定其吸光度，并準確記錄數值。繪制山奈素標準曲線時，縱坐標為測定的吸光度(A)，橫坐標為山奈素對照品溶液的質量濃度( μg·mL-1)[13]。進行回歸分析，得其回歸方程為y = 0.0828x - 0.0017， r =0.9992。木賊山奈素含量在1.68～8.40 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.4 木賊山奈素水解條件的正交設計

根據前期查閱文獻和預實驗預情況[10～13]，采用正交實驗設計，安排三個因素：水解時間(min)、水解溫度(℃)和加入濃鹽酸的量(mL)，每個因素設置3個水平。用L9(34)正交表進行正交實驗 ，各因素水平見表3。

表3 木賊山奈素水解條件因素水平

2.5 木賊山萘素含量測定

精密量取2.2中制備的木賊山奈素供試品溶液1 mL轉移至50 mL容量瓶中，加75 %甲醇溶解至刻度線，搖勻。在最大吸收波長下測定其吸光度，將吸光度平均值帶入標準曲線方程，計算得出的數值即為山奈素供試品溶液的質量濃度。測定的結果及正交分析見表4和表5。由R值可知，各個因素對木賊山萘酚提取時的影響 ：加濃鹽酸量>水解時間>提取溫度，且C2>C1>C3，A1>A2>A3，B2>B3>B1，由此可見水解最佳條件為A1B2C2。表5的方差分析表中C因素的(加鹽算量)F0.05

2.6 重復性實驗

由于正交實驗優選出的工藝路線(A1B1D2)不在實驗設計方案中，因此需進行實驗驗證。稱3份木賊粉，按優選出的水解條件制備供試品溶液，結果見表6。

由表6可知，此條件下木賊山奈素的含量在5.721～6.248 ug·mL-1,平均含量為6.092 ug·mL-1。與實驗2方案(A1B2C2)的含量接近。說明優選出的工藝路線(A1B1D2:加鹽酸2.5 mL、60℃水解30 min)是木賊山萘素穩定、合理、可行的水解條件。

表4 山奈素水解條件L9(34)正交試驗結果

注：D為空白項。

表5 山奈素水解條件方差分析

F(2、4)0.05=19，F(2、4)0.01=99。

表6 木賊山奈素的含量測定結果 (n=3)

3 討論

實驗在提取木賊山奈素時考慮到提取溶劑甲醇毒性大，因而改用75%乙醇進行提取，通過前期的預實驗進行了考察，發現75%的乙醇提取完全，得到木賊山奈素含量較高。且乙醇毒性小，因此最終采用75%的乙醇提取樣品。在測定各因素水平木賊山奈素含量時，紫外分光光度法測得的一系列結果一致程度好，具有準確、操作簡單的特點。故筆者實驗采用以山奈素為指標性成分，通過紫外分光光度法測定山奈素含量，以此來比較優選木賊山奈素的最佳水解條件。