水稻Histone3同源蛋白序列和基因表達特性分析

胡明瑜 白文欽 潘曉雪 吳紅 雷開榮

摘? ?要? ?組蛋白Histone3是表觀遺傳調控的重要靶蛋白。同一物種中往往有多個Histone3同源基因，這些同源基因在生物學功能上是否有差異尚不清楚。本研究對水稻的8個Histone3同源蛋白作了比較，發現在N端序列差異相對較大。在“秀水03”和“日本晴”中，8個Histone3同源基因的表達特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在大部分組織器官中組成型表達，而其他Histone3同源基因的表達水平較低;部分同源基因在種子、花粉囊和雌蕊等組織器官中特異性高表達。進一步分析這些同源基因的上游調控序列，發現具有大量的生長調節劑和環境信號調控元件，以及組織特異性表達相關元件，并且不同基因中的調控元件有一定差別，如在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中含有生長素應答元件，而在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中含有赤霉素應答元件。這些結果表明，水稻Histone3同源基因不僅編碼的氨基酸序列有差異，而且在表達調控上也有較大差別，暗示這些基因在生物學功能上可能有所差異。

關鍵詞? ? 水稻;組蛋白;OsHistone3;基因表達;表觀遺傳調控

中圖分類號：S511.5;Q78? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.31.001

表觀遺傳調控在植物適應不同生物逆境的過程中發揮著重要作用[1]。近幾年，越來越多的證據表明，植物抗病性與DNA/RNA甲基化、非編碼RNA表達和組蛋白修飾等表觀遺傳調控密切相關。例如，在擬南芥中，利用siRNAs （small interference RNAs）介導RNA依賴性的DNA甲基化，對DNA特定位點進行修飾，可增強對病毒的防御能力[1]。在侵染擬南芥的溴病毒（bromovirus）中，腺嘌呤甲基化程度與擬南芥抵抗侵染的能力相關，表明RNA水平的甲基化也與抗病性相關[2]。

組蛋白修飾是表觀遺傳調控的重要方式，包括組蛋白乙?；?、甲基化和泛素化等。擬南芥突變體Atelp2和Atelp3-10對十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）等病原菌高度敏感，研究發現，受到病原體侵染時，AtELP2和AtELP3蛋白促進防御應答基因表達，而這與AtELP2和AtELP3的組蛋白乙酰轉移酶活性有關[3-4]。擬南芥ATX1蛋白具有組蛋白甲基轉移酶活性，能夠激活拮抗水楊酸和茉莉酸甲酯信號的WRKY70基因表達，并維持該基因核小體的Histone3組蛋白在K4位的三甲基態;同時，水楊酸信號應答基因PR1和茉莉酸甲酯信號應答基因THI2.1的核小體也是ATX1蛋白的作用靶點[5]。擬南芥組蛋白甲基轉移酶SDG8（set domain group 8）通過調控茉莉酸甲酯和乙烯信號相關基因，來防御真菌病原侵染;其功能缺失突變體sdg8-1對蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）和灰葡萄孢菌石竹變種（Botrytis cinerea）等病原菌的防御能力降低[6]。進一步研究發現，SDG8和SDG25調控損傷相關內源性肽pep1、細菌鞭毛蛋白flg22和效應物誘發的植物免疫反應和系統性抵抗反應[7]。在玉米中，對赤藻莖腐病抗性與ZmCCT基因表達水平相關;在感病株系中發現ZmCCT基因上游調控序列中插入轉座子元件，使組蛋白激活標簽H3K4me3被刪除，并引入大量甲基化的GC序列，導致ZmCCT基因在病原菌侵染時無法誘導表達[8]。黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）侵染水稻時，誘導15個組蛋白賴氨酸去甲基化酶（Jumonji C）基因表達;在jmj704突變株中H3K4me2/3標記水平顯著增加，表明JMJ704蛋白可能調控H3K4me2/3的去甲基化[9]。此外，用大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）毒素處理擬南芥組蛋白H2B單泛素化相關突變體（hub1-4、hub2-2、ubc1-1、hub1-4/hub2-2、ubc1-1/ubc2-2等），發現組蛋白H2B單泛素化在防御反應中參與調控了微管的動力學特性[10]。這些證據表明在受到病原侵染時，植物的防御反應與組蛋白修飾緊密相關，開展組蛋白及其修飾酶的研究對于揭示植物抗病機理有重要意義。

已有研究表明，組蛋白Histone3具有多種修飾酶（如甲基化酶ATX1、SDG8、SDG25和去甲基化酶家族JMJCs等）及多個修飾位點（如H3K4、H3K9和H3K27等），而且Histone3的不同修飾參與調控植物生長發育和對病原菌的防御反應[11]，這說明Histone3是植物進行表觀遺傳調控的重要靶蛋白和紐帶，在植物生長發育調控和抵抗病原菌方面具有重要作用;不過，目前對Histone3基因自身的表達特性還研究較少。為了解Histone3基因是否可能在轉錄水平參與植物表觀遺傳調控，我們對水稻Histone3同源基因的編碼蛋白進行了比較，并對基因表達特性進行分析，發現水稻中有8個Histone3同源基因，根據編碼蛋白質的同源性可分為4組，同源蛋白間N端序列差異相對較大。表達分析顯示，8個Histone3同源基因在“秀水03”和“日本晴”中表達特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同組織器官中組成型表達，而其他Histone3同源基因表達水平較低，LOC_Os12g22680、LOC_Os05g41080和LOC_Os02g25910分別在種子、花粉囊和雌蕊中相對高表達。對Histone3同源基因上游調控序列分析，發現存在多種生長調節劑的信號調控元件和環境響應元件，同時還有胚乳、莖尖、分生組織等部位特異表達元件。水稻Histone3同源基因之間的上游調控序列包含的順式調控元件也存在差異，如生長素應答元件主要在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中，而赤霉素應答元件主要在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中，這表明水稻Histone3同源基因在生物學功能上可能有所差異。綜合而言，編碼Histone3蛋白同源性高的基因表達特性相似，部分水稻Histone3基因具有組織表達特異性。這為進一步探索Histone3同源蛋白在調控植物生長發育和防御反應中的不同作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1? ?試驗材料

1.1.1 植物材料

“秀水03”（Oryza sativa L. “Xiushui 03”），是逆境農業研究重慶市重點實驗室保存的特早熟晚粳稻品種;“日本晴”（Oryza sativa L. “Nipponbare”），是國際水稻基因組計劃中的典型粳稻基因組供體，完成了全基因組測序，是常用的水稻研究材料。

1.1.2 試劑

Trizol法總RNA提取試劑盒，購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻Histone3同源蛋白序列分析

利用Lasergene的MegAlign程序分析水稻Histone3同源蛋白序列。采用Clustal W方法進行計算，參數為軟件默認。

1.2.2 “秀水03”轉錄組測序

“秀水03”種子萌發2周后，取15棵幼苗幼根，液氮研磨，用Trizol法提取總RNA備用;隨機抽取15棵田間正常生長的“秀水03”植株，分別用解剖刀取第二、三片完全展開葉，取第二、三節莖，取開花前和開花后果穗，液氮研磨，用Trizol法提取總RNA備用;從根、莖、葉和穗提取的總RNA樣品檢測合格后，由上海美吉生物醫藥科技有限公司做轉錄組測序。

2 結果與分析

2.1 水稻Histone3同源蛋白序列比較

表觀遺傳學研究認為，Histone3蛋白的序列變異和修飾與基因表達調控關系密切。為了解水稻中Histone3同源蛋白序列差異，在國家水稻數據中心（http：//www.ricedata.cn/index.htm）查找到8個水稻Histone3同源基因，基因編號分別為LOC_Os11g05730、LOC_Os12g22680、LOC_Os06g06510、LOC_Os05g41080、LOC_Os04g34240、LOC_Os06g04030、LOC_Os03g27310和LOC_Os02g25910，對應蛋白質分別標記為Os11g05730、Os12g22680、Os06g06510、Os05g41080、Os04g34240、Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910。

用Clustal W軟件對蛋白質序列同源性做了分析（見圖1A）。結果顯示，Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910的蛋白質同源性較高，其中Os06g04030和Os03g27310蛋白質序列相同，Os02g25910與前兩者的序列一致性達到85.3%。Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240編碼的蛋白質同源性較高，其中Os11g05730和Os06g06510蛋白質序列相同，Os04g34240蛋白在N端多出138個氨基酸殘基，其余部分序列與Os11g05730和Os06g06510蛋白質序列相同。Os12g22680和Os05g41080編碼的蛋白質與其他Histone3同源蛋白序列差異相對較大，序列一致性在57%～82%。根據水稻Histone3蛋白同源性分析結果構建進化樹（圖1B），可將8個水稻Histone3蛋白分成4組（組1：Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240;組2：Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910;組3：Os12g22680;組4：Os05g41080）。這說明水稻中Histone3同源蛋白在序列上存在一定差異，N端序列差異相對較大。

2.2 水稻“秀水03”中Histone3同源基因表達特性

為了解水稻Histone3同源基因的表達特性，利用特早熟粳稻品種“秀水03”的根、莖、葉和穗的轉錄組數據，分析Histone3同源基因表達情況。結果表明，8個Histone3同源基因均檢測到轉錄本（見圖2）。其中組2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在根、莖、葉和穗中組成型表達，FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）值均在200以上;而LOC_Os02g25910在根、葉和穗中表達量極低，在莖中相對高表達。在組1中LOC_ Os11g05730、LOC_ Os06g06510和LOC_ Os04g34240表達特征相似，LOC_Os11g05730和LOC_Os06g06510在幼根和葉中表達相對較高，LOC_Os04g34240在幼根中表達相對較高。組3的LOC_Os12g22680在果穗中高表達，在其他部位表達量極低。組4的LOC_ Os05g41080在幼根和莖中相對高表達。這些數據初步表明“秀水03”中Histone3同源基因表達水平差異較大，部分Histone3同源基因存在組織表達特異性。

2.3 “日本晴”中Histone3同源基因表達特性

利用RGAP數據庫[12]（The MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource， http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）分析水稻Histone3同源基因的表達模式。結果表明，在“日本晴”中，組2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同發育時期的芽、葉、胚、種子、果穗、花粉囊、雌蕊等部位組成型高表達（見圖3A），其中LOC_Os06g04030在雌蕊中的FPKM值高達934;而LOC_Os02g25910在各組織器官表達量較低，在花粉囊中相對高表達（圖3B）;組1的LOC_Os11g05730、LOC_Os06g06510和LOC_Os04g34240表達特征相似，在不同發育時期的果穗、雌蕊、芽、種子（5DPA）和胚（25DPA）等部位高表達;組3的LOC_Os12g22680在種子（5DPA）中表達量相對較高;組4的LOC_Os05g41080在雌蕊和果穗中表達量相對較高（圖3B）。這些數據進一步說明，水稻Histone3同源基因的表達水平差異較大，部分Histone3同源基因在雌蕊、花粉囊和種子（5DPA）等部位特異表達。

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（責任編輯：丁志祥）