PESA和TESA精子及凍融后對ICSI助孕結局的影響*

余柯達 陳 曉 楊麗華 毛佳婷 鄒立波 師 帥 劉 鴻

金華市人民醫院生殖醫學中心（浙江金華 321000）

自從Palermo等[1]首次通過卵胞漿內單精子注射（ICSI）獲得妊娠后，男性不育癥患者可通過ICSI得到有效的治療。對于男性不育癥中的無精子癥，在確診梗阻性無精子癥還是非梗阻性無精子癥時需要通過經皮附睪精子抽吸術（PESA）和睪丸精子抽吸術（TESA）進行檢查，為避免反復穿刺給患者帶來損傷，很多生殖醫學中心會將檢查后確認有精子的PESA和TESA標本進行冷凍保存，用于后續的ICSI周期。

不同來源 （PESA/TESA）的精子是否會影響ICSI助孕的結局，目前國內外研究無統一結論[2-6]。PESA和TESA精子經過凍融后會受到一定的損傷，其是否會影響ICSI助孕的結局目前還存在爭議。有研究結果表明凍融的PESA和TESA精子對ICSI的受精率、早期胚胎質量和臨床妊娠率等無影響[2,7-10]，但也有些學者認為凍融的精子會對ICSI助孕結局造成影響[11,12]。本研究對在本院生殖中心接受ICSI治療的312個周期進行回顧性分析，旨在探討不同來源精子（PESA/TESA）和凍融TESA/PESA精子對ICSI助孕結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2017年2月在金華市人民醫院生殖醫學中心因男方無精子癥接受采用PESA或TESA精子行ICSI治療的312個周期。根據ICSI的精子來源不同，分為新鮮PESA精子組（P組）117周期，新鮮TESA精子組（T組）66周期，凍融PESA精子組（FP組）85周期，凍融TESA精子組（FT組）44周期。

納入標準：（1）男方至少3次精液分析，經離心沉淀后鏡檢未見精子，PESA或TESA可見成熟精子；（2）第1 周期行 ICSI助孕治療；（3）女方年齡＜35 歲；（4）夫婦雙方染色體均正常；（4）女方無子宮畸形、子宮內膜異位癥和卵巢功能衰竭等。所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

（一）超排方案

女方超排卵均采用GnRH-a長方案，注射促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達菲林，法國益普生生物制藥公司）進行降調，達到降調標準后，開始注射重組人促卵泡激素（rFSH，果納芬，瑞士雪蘭諾公司）或人絕經期促性腺激素（hMG，珠海麗珠公司）促排卵，并根據卵泡發育、子宮內膜及血清雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）的值調整劑量，當至少3個卵泡≥18 mm時停用促排藥，注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，艾澤，瑞士雪蘭諾公司）6000 U，36 h后取卵。

（二）PESA和TESA精子獲取、冷凍和復蘇

1.PESA：患者取仰臥位，常規消毒鋪巾，進行局部麻醉。經皮穿刺附睪頭部，抽取附睪液，并在倒置顯微鏡下尋找活動精子。若附睪液中無活動精子，甚至無精子，則行對側附睪穿刺。若兩側附睪均無精子，則行TESA。

2.TESA：消毒麻醉同PESA，經皮穿刺睪丸，抽吸出睪丸組織液和少量生精小管，將生精小管撕碎后，在倒置顯微鏡下檢查有無精子。若無精子，則穿刺對側睪丸。

精子冷凍和復蘇參照精子冷凍液（vitrolife）的使用說明書的操作步驟進行。

（三）受精、卵裂、胚胎質量觀察及妊娠結局隨訪

取卵當天行常規ICSI，受精16～18 h后觀察受精情況，其中2 PN為正常受精，再觀察第2天和第3天胚胎卵裂情況，第3天早期胚胎的卵裂球≥6，細胞大小均勻或基本均勻，碎片≤20%為優質胚胎，選擇正常受精卵卵裂而來的優質胚胎或有效胚胎進行移植。胚胎移植30 d后B超檢查宮腔，內見孕囊確診為臨床妊娠。對妊娠夫婦每3個月進行一次隨訪并作記錄。

三、統計學分析

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，采用t檢驗。計數資料比較采用卡方檢驗，當病例數≥40且理論頻數≥5時，采用普通卡方檢驗；當病例數≥40，但1≤理論頻數＜5時，采用校正的卡方檢驗；當病例數＜40或理論頻數＜1時，采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、凍存附睪、睪丸精子的復蘇情況和患者基礎臨床資料比較

85個周期凍存附睪精子和44個周期凍存睪丸精子進行復蘇后，每個周期均能找到足夠數量的活動精子進行ICSI，附睪、睪丸精子的凍融復蘇成功率均為100%。患者基礎臨床資料方面，4組之間的女方年齡、男方年齡和不孕年限均無統計學差異（P＞0.05，表 1）。

二、受精情況與胚胎質量

由表1可知，P組的受精率為78.12%，而T組僅為71.04%，具有極顯著統計學差異（P＜0.01）。精子經過冷凍復蘇后，FP組的受精率仍高達 77.65%，FT組為69.57%，FP組與P組、FT組與T組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）；且FP組的受精率顯著高于FT組，差異具統計學意義（P＜0.01）。P組、T組、FP組和FT組的卵裂率分別為97.45%、97.93%、96.86%和98.18%，精子不同來源的P組與T組、FP組與FT組之間差異均無統計學意義（P＞0.05）；且經過冷凍復蘇后的FP組、FT組的卵裂率也與采用新鮮精子的P組、T組無統計學差異（P＞0.05）。有效胚胎率和優質胚胎率也與卵裂率情況一致。總之，除不同來源的精子之間受精率有顯著差異性（P＜0.01）之外，不同來源的精子，無論是新鮮的還是凍融的精子，其卵裂率、有效胚胎率和優質胚胎率均無統計學差異（P＞0.05）。

三、臨床妊娠情況比較

胚胎移植后，P組、T組、FP組和FT組的胚胎種植率分別為31.19%、30.36%、31.25%和33.33%，精子不同來源的P組與T組、FP組與FT組之間差異均無統計學意義（P＞0.05），且經過冷凍復蘇后的FP組、FT組的胚胎種植率也與采用新鮮精子的P組、T組差異無統計學意義（P＞0.05）。臨床妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率和異位妊娠率也與胚胎種植率一致。不同來源的精子，無論是新鮮還是凍融的精子其胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率和異位妊娠均無統計學差異（P＞0.05，表 2）。

表1 4組基本情況和胚胎發育情況比較

表2 4組臨床妊娠情況比較

討 論

一個成熟的精子必須具備一些生理生化指標才能使它獲得受精能力，然而顯微操作輔助的受精實驗表明大多數的高度特化精子在成熟過程中逐漸獲得的功能只需要將精子的細胞核注射到卵子就能代替那些功能，從而激活卵子[1]。因此ICSI技術成為了男性不育癥患者，特別是無精子癥患者的有效治療方式，梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥患者通過PESA或TESA獲得附睪或睪丸精子行ICSI治療。不同來源的精子對ICSI治療中的胚胎發育和臨床結局的影響，目前國內外的研究均無統一結論。

王俊霞等[3]報道PESA/TESA不同來源的精子對受精率、卵裂率、臨床妊娠率等均無顯著差異，但PESA的流產率顯著低于TESA。冼志勇等[13]也認為PESA和TESA之間的臨床妊娠率無顯著性差異。而有些研究結果表明附睪來源的精子受精率顯著高于TESA，且流產率差異無顯著性[4,5]。Dozortsev等[6]的研究結果則認為不同精子來源中的PESA的受精率雖然顯著高于TESA，但臨床妊娠率顯著低于TESA，流產率則高于TESA。而董瑞娜等[2]認為不僅PESA的受精率、卵裂率顯著高于TESA，而且胚胎種植率、臨床妊娠率也顯著高于TESA。本研究結果表明，新鮮PESA精子組（P組）的受精率為78.12%，而新鮮TESA精子組（T組）僅為71.04%，具有極顯著統計學差異（P＜0.01），而卵裂率、有效胚胎率、優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率和異位妊娠率兩組間差異無統計學意義（P＞0.05），凍融后的FP組和FT組之間也具有上述同樣的結果，這與林小民[4]和謝多等[5]的研究結果一致。在睪丸中精子具備完整的父源遺傳物質，已完成減數分裂，在循附睪頭體尾運動和在附睪儲存的過程中，精子的形態和生理生化功能進一步發生改變，最終獲得運動能力、精卵識別能力和受精能力，因此睪丸中的精子對卵子的激活能力比附睪中的低，所以導致TESA精子的受精率顯著低于PESA精子。

凍融TESA和PESA精子對ICSI助孕結局的影響目前國內外尚無統一的結論。Romero等[11]認為凍融睪丸精子的受精率高于新鮮睪丸精子，對卵裂率和胚胎質量無影響。而Verheyen等[12]則認為凍融睪丸精子對受精率無影響，但嚴重降低了卵裂率。然而國內外多數研究結果表明[2,7-10]，凍融TESA和PESA與新鮮TESA和PESA之間的受精率、卵裂率、優質胚胎率、多胎率、流產率和異位妊娠率等均無統計學差異。本研究結果也表明凍融TESA和PESA精子對ICSI結局中的受精率、卵裂率、有效胚胎率、優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產率、多胎妊娠率和異位妊娠率無影響。究其原因可能是在精子冷凍和復蘇的過程中雖然會對精子產生損傷，但也起到了篩選的作用，只有代謝旺盛、活力好的精子才能存活下來。

受目前試管嬰兒成功率的限制，無精子癥患者可能會進行多次附睪或睪丸穿刺，還要面臨取不到精子的可能，重復的睪丸手術取精會導致患者睪丸的損傷和大量的睪丸組織丟失，并引起睪丸組織纖維化、睪丸萎縮等并發癥[10]。因此本文建議將檢查到具有精子的附睪和睪丸活檢的樣品或ICSI治療周期剩余的PESA和TESA精子進行冷凍保存，可用于接下來的ICSI周期，避免患者多次附睪或睪丸穿刺取精帶來的損傷。