電針對(duì)腦卒中后抑郁大鼠血清白介素-1β、白介素-6和腫瘤壞死因子-α表達(dá)的影響

腦卒中后抑郁(post stroke depression，PSD)是指腦卒中后病人出現(xiàn)的以心情低落、失眠、意識(shí)活動(dòng)減少等為主要表現(xiàn)的情感障礙性疾病。據(jù)調(diào)查，腦卒中后2～5年內(nèi)PSD發(fā)生率為30%左右[1]。多項(xiàng)研究顯示，電針治療能顯著改善PSD的抑郁癥狀[2]。PSD屬于腦卒中后病人的應(yīng)激反應(yīng)之一，而應(yīng)激反應(yīng)與皮質(zhì)醇升高有關(guān)[3]。腦卒中后中樞系統(tǒng)和腎上腺系統(tǒng)的下丘腦垂體腎上腺(HPA)軸的調(diào)節(jié)功能發(fā)生紊亂[4-5]。下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)，同時(shí)其促使腦垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，ACTH促使腎上腺釋放皮質(zhì)醇，當(dāng)糖皮質(zhì)激素受體(GR)檢測(cè)到皮質(zhì)醇增多時(shí)，其會(huì)傳遞負(fù)反饋信號(hào)促使下丘腦減少CRH的釋放，這就是HPA軸的內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制[6]。皮質(zhì)醇增多、GR失敏與PSD的嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。促炎癥因子的水平升高激活炎癥反應(yīng)，促炎癥因子如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等通過(guò)干擾GR的調(diào)節(jié)來(lái)擾亂HPA軸的功能。核因子κB(NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5(STAT5)是促炎癥因子的主要介質(zhì)，可通過(guò)各種活動(dòng)抑制GR的功能[7-10]。促炎癥因子也可通過(guò)激活GRβ來(lái)抑制GR的功能[11-12]。促炎癥因子在海馬體中聚集并損傷神經(jīng)功能。有研究顯示，抑郁病人體內(nèi)的TNF-α、 IL-6含量較高[13]。本研究通過(guò)探究電針對(duì)PSD大鼠血清IL-1β、 TNF-α和IL-6表達(dá)的影響來(lái)闡明針刺治療PSD的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選取雄性SD大鼠24只，體重220～250 g，3月齡，置于室溫(24±2)℃、每12 h晝夜交替、(60±5)%濕度的動(dòng)物房?jī)?nèi)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將動(dòng)物隨機(jī)分為正常組、模型組、電針組，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器 IL-1β檢測(cè)試劑盒、TNF-α檢測(cè)試劑盒、IL-6檢驗(yàn)試劑盒(上海喬羽生物技術(shù)有限公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。佳健牌針灸針(無(wú)錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司)；Multiskan-3型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)。

1.3 模型制備及方法 建立大鼠中腦動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型[14]：結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和頸外動(dòng)脈(ECA)的近心端，阻斷頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。在距 CCA 分叉部 5 mm 處剪小口，把線栓插入ICA。MCAO模型建立完成3 d后建立慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUMS)模型：潮濕墊料、冰水游泳、夾尾、禁水、懸尾、黑白顛倒、鼠籠傾斜 、禁食、行為限制等多種應(yīng)激，每日隨機(jī)安排，持續(xù)1個(gè)月[15]。正常組：即未經(jīng)過(guò)MCAO術(shù)和CUMS術(shù)的大鼠；模型組：即MCAO術(shù)和CUMS術(shù)后大鼠；電針組：PSD模型大鼠予電針治療，取穴百會(huì)、神庭，電針頻率為2 Hz和20 Hz，每3 s交替1次，每日1次，每次30 min，連續(xù)治療1個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 ①行為學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)第1個(gè)月后采用糖水實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型大鼠行為學(xué)變化情況。糖水實(shí)驗(yàn)是在造模前訓(xùn)練所有大鼠適應(yīng)飲用糖水，在測(cè)試前禁食禁水24 h，后同時(shí)給予一瓶糖水和一瓶純水，通過(guò)1 h內(nèi)大鼠消耗的蔗糖/消耗的液體總量比來(lái)測(cè)定大鼠的快感缺乏程度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是將大鼠放置于1 m×1 m×0.5 m黑色敞箱底的中心方格內(nèi)，記錄大鼠在5 min內(nèi)的活動(dòng)情況，以至少3爪均進(jìn)入的方格數(shù)記為移動(dòng)次數(shù)。②運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，每組取 8只大鼠，每只大鼠麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置后，4 ℃、 3 000 r/min離心15 min，取上清液保存?zhèn)溆谩Ｊ紫认♂寴?biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃、 40 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL。將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃、20 min，洗板。每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置37 ℃、10 min，洗板。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值。隨后畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)的IL-1β、 IL-6和TNF-α含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠行為學(xué)改變

2.1.1 糖水偏愛(ài)比比較 與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛(ài)比顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠糖水偏愛(ài)比顯著上升(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。

與正常組比較，※P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖1 3組大鼠糖水偏愛(ài)比比較

2.1.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為比較 與正常組比較，模型組大鼠移動(dòng)次數(shù)顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠移動(dòng)次數(shù)顯著增加(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

與正常組比較， ※P<0.01；與模型組比較， #P<0.01圖2 3組大鼠移動(dòng)次數(shù)比較

2.2 大鼠血清IL-1β表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠血清IL-1β表達(dá)降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3。

與正常組比較 ，※P<0.05；與模型組比較， #P<0.05圖3 3組大鼠血清IL-1β表達(dá)水平比較

2.3 大鼠血清TNF-α表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠血清TNF-α表達(dá)顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖4。

與正常組比較， ※P<0.01；與模型組比較， #P<0.05圖4 3組大鼠血清TNF-α表達(dá)水平比較

2.4 大鼠血清IL-6表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠血清IL-6表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。詳見(jiàn)圖5。

與正常組比較，※P<0.05；與模型組比較， #P<0.05圖5 3組大鼠血清IL-6表達(dá)水平比較

3 討 論

中醫(yī)理論認(rèn)為腦為髓之海，五臟六腑之精氣均上充于腦，神又寄存于腦，腦神為心神所統(tǒng)帥，心腦共主神明，故健腦則神明，神明則抑郁癥狀減輕甚至消失，故治療PSD以調(diào)神醒腦開(kāi)郁為導(dǎo)向。根據(jù)近年來(lái)針灸治療PSD的取穴規(guī)律，結(jié)合長(zhǎng)期臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，提出以百會(huì)、神庭為主穴治療PSD。百會(huì)、神庭為督脈穴，督脈總督諸陽(yáng)，兩穴合參可振奮陽(yáng)氣、醒腦開(kāi)竅、暢達(dá)情志。

本研究結(jié)果表明，PSD大鼠糖水偏愛(ài)比和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)移動(dòng)次數(shù)顯著下降，可顯示其抑郁癥狀顯著；而電針治療可以明顯改善PSD大鼠糖水偏愛(ài)比和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)移動(dòng)次數(shù)，說(shuō)明電針可以有效地改善PSD大鼠的抑郁癥狀。PSD激活炎癥反應(yīng)， GR受抑制，CRH、ATCH增多，HPA失調(diào)[7]；炎癥反應(yīng)激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，線粒體功能受損，GR再次被抑制，CRH、ACTH進(jìn)而升高，加重HPA軸失調(diào)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，促炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α增加[8-11，16]，最終呈惡性循環(huán)，加重PSD的抑郁癥狀。而電針治療可顯著減少促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終減輕PSD。

綜上所述，電針能有效改善PSD的抑郁癥狀與減少促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，進(jìn)而減少炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)為課題組進(jìn)一步探究電針治療PSD的機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，有關(guān)電針是否通過(guò)調(diào)節(jié)HPA軸從而減少促炎癥反應(yīng)來(lái)改善PSD的抑郁癥狀需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。