電針對腦卒中后抑郁大鼠血清白介素-1β、白介素-6和腫瘤壞死因子-α表達的影響

腦卒中后抑郁(post stroke depression，PSD)是指腦卒中后病人出現的以心情低落、失眠、意識活動減少等為主要表現的情感障礙性疾病。據調查，腦卒中后2～5年內PSD發生率為30%左右[1]。多項研究顯示，電針治療能顯著改善PSD的抑郁癥狀[2]。PSD屬于腦卒中后病人的應激反應之一，而應激反應與皮質醇升高有關[3]。腦卒中后中樞系統和腎上腺系統的下丘腦垂體腎上腺(HPA)軸的調節功能發生紊亂[4-5]。下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)，同時其促使腦垂體釋放促腎上腺皮質激素(ACTH)，ACTH促使腎上腺釋放皮質醇，當糖皮質激素受體(GR)檢測到皮質醇增多時，其會傳遞負反饋信號促使下丘腦減少CRH的釋放，這就是HPA軸的內穩態機制[6]。皮質醇增多、GR失敏與PSD的嚴重程度緊密相關。促炎癥因子的水平升高激活炎癥反應，促炎癥因子如白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等通過干擾GR的調節來擾亂HPA軸的功能。核因子κB(NF-κB)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及轉錄激活蛋白5(STAT5)是促炎癥因子的主要介質，可通過各種活動抑制GR的功能[7-10]。促炎癥因子也可通過激活GRβ來抑制GR的功能[11-12]。促炎癥因子在海馬體中聚集并損傷神經功能。有研究顯示，抑郁病人體內的TNF-α、 IL-6含量較高[13]。本研究通過探究電針對PSD大鼠血清IL-1β、 TNF-α和IL-6表達的影響來闡明針刺治療PSD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取雄性SD大鼠24只，體重220～250 g，3月齡，置于室溫(24±2)℃、每12 h晝夜交替、(60±5)%濕度的動物房內。適應性飼養1周后將動物隨機分為正常組、模型組、電針組，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器 IL-1β檢測試劑盒、TNF-α檢測試劑盒、IL-6檢驗試劑盒(上海喬羽生物技術有限公司)；其他試劑均為國產分析純。佳健牌針灸針(無錫佳健醫療器械股份有限公司)；Multiskan-3型酶標儀(美國Thermo)。

1.3 模型制備及方法 建立大鼠中腦動脈閉塞(MCAO)模型[14]：結扎右側頸總動脈(CCA)和頸外動脈(ECA)的近心端，阻斷頸內動脈(ICA)。在距 CCA 分叉部 5 mm 處剪小口，把線栓插入ICA。MCAO模型建立完成3 d后建立慢性不可預見性應激(CUMS)模型：潮濕墊料、冰水游泳、夾尾、禁水、懸尾、黑白顛倒、鼠籠傾斜 、禁食、行為限制等多種應激，每日隨機安排，持續1個月[15]。正常組：即未經過MCAO術和CUMS術的大鼠；模型組：即MCAO術和CUMS術后大鼠；電針組：PSD模型大鼠予電針治療，取穴百會、神庭，電針頻率為2 Hz和20 Hz，每3 s交替1次，每日1次，每次30 min，連續治療1個月。

1.4 觀察指標及檢測方法 ①行為學觀察：實驗前和實驗第1個月后采用糖水實驗和曠場實驗評價模型大鼠行為學變化情況。糖水實驗是在造模前訓練所有大鼠適應飲用糖水，在測試前禁食禁水24 h，后同時給予一瓶糖水和一瓶純水，通過1 h內大鼠消耗的蔗糖/消耗的液體總量比來測定大鼠的快感缺乏程度。曠場實驗是將大鼠放置于1 m×1 m×0.5 m黑色敞箱底的中心方格內，記錄大鼠在5 min內的活動情況，以至少3爪均進入的方格數記為移動次數。②運用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，每組取 8只大鼠，每只大鼠麻醉后，于腹主動脈取血5 mL，靜置后，4 ℃、 3 000 r/min離心15 min，取上清液保存備用。首先稀釋標準品，加入準備好的樣品和標準品，每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，將反應板充分混勻后置37 ℃、 40 min。用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL。將反應板充分混勻后置37 ℃、20 min，洗板。每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應板置37 ℃、10 min，洗板。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內用酶標儀在450 nm處測吸光值。隨后畫出標準曲線，根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應的IL-1β、 IL-6和TNF-α含量。

2 結 果

2.1 大鼠行為學改變

2.1.1 糖水偏愛比比較 與正常組比較，模型組大鼠糖水偏愛比顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠糖水偏愛比顯著上升(P<0.01)。詳見圖1。

與正常組比較，※P<0.01；與模型組比較，#P<0.01圖1 3組大鼠糖水偏愛比比較

2.1.2 曠場實驗行為比較 與正常組比較，模型組大鼠移動次數顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠移動次數顯著增加(P<0.01)。詳見圖2。

與正常組比較， ※P<0.01；與模型組比較， #P<0.01圖2 3組大鼠移動次數比較

2.2 大鼠血清IL-1β表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠血清IL-1β表達降低(P<0.05)。詳見圖3。

與正常組比較 ，※P<0.05；與模型組比較， #P<0.05圖3 3組大鼠血清IL-1β表達水平比較

2.3 大鼠血清TNF-α表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α表達水平顯著上升(P<0.01)。與模型組比較，電針組大鼠血清TNF-α表達顯著降低(P<0.05)。詳見圖4。

與正常組比較， ※P<0.01；與模型組比較， #P<0.05圖4 3組大鼠血清TNF-α表達水平比較

2.4 大鼠血清IL-6表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6表達水平顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，電針組大鼠血清IL-6表達水平顯著降低(P<0.05)。詳見圖5。

與正常組比較，※P<0.05；與模型組比較， #P<0.05圖5 3組大鼠血清IL-6表達水平比較

3 討 論

中醫理論認為腦為髓之海，五臟六腑之精氣均上充于腦，神又寄存于腦，腦神為心神所統帥，心腦共主神明，故健腦則神明，神明則抑郁癥狀減輕甚至消失，故治療PSD以調神醒腦開郁為導向。根據近年來針灸治療PSD的取穴規律，結合長期臨床實踐經驗，提出以百會、神庭為主穴治療PSD。百會、神庭為督脈穴，督脈總督諸陽，兩穴合參可振奮陽氣、醒腦開竅、暢達情志。

本研究結果表明，PSD大鼠糖水偏愛比和曠場實驗移動次數顯著下降，可顯示其抑郁癥狀顯著；而電針治療可以明顯改善PSD大鼠糖水偏愛比和曠場實驗移動次數，說明電針可以有效地改善PSD大鼠的抑郁癥狀。PSD激活炎癥反應， GR受抑制，CRH、ATCH增多，HPA失調[7]；炎癥反應激活氧化應激反應，線粒體功能受損，GR再次被抑制，CRH、ACTH進而升高，加重HPA軸失調，進一步加重炎癥反應，促炎癥因子IL-1β、 IL-6和TNF-α增加[8-11，16]，最終呈惡性循環，加重PSD的抑郁癥狀。而電針治療可顯著減少促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，減少炎癥反應進而抑制氧化應激反應，最終減輕PSD。

綜上所述，電針能有效改善PSD的抑郁癥狀與減少促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達，進而減少炎癥反應。本實驗為課題組進一步探究電針治療PSD的機制奠定了堅實的基礎，有關電針是否通過調節HPA軸從而減少促炎癥反應來改善PSD的抑郁癥狀需要進行進一步的實驗研究。