血漿游離DNA在非小細(xì)胞肺癌診斷中的價(jià)值分析

王健 董棟 渠敬明 李龍飛 周厚文 吳秀娟（通訊作者）

（1 徐州市腫瘤醫(yī)院腫防辦/胸外科 江蘇 徐州 221003 ）

（2 徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 江蘇 徐州 221003）

肺癌為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的病死率。肺癌結(jié)構(gòu)中，85%屬于非小細(xì)胞肺癌（NSCLCA），且NSCLCA患者中，70%發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期，喪失最佳治療機(jī)會(huì)[1]。因此對(duì)于NSCLCA需早期開(kāi)展診斷，早期治療提高治療效果。血漿游離NDA為一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)記物，有望在腫瘤疾病診斷中成為新的標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)，因此本次重點(diǎn)分析NSCLCA患者檢測(cè)血漿游離DNA臨床意義，具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月－12月期間我院收治的40例NSCLCA患者為研究組，患者經(jīng)細(xì)胞學(xué)或者病理學(xué)診斷確定為NSCLCA，本次檢測(cè)分析前患者均未進(jìn)行手術(shù)、化療以及放療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：病毒性肝炎；HIV等感染性疾病；全身系統(tǒng)性疾病等患者。腺癌患者21例，鱗癌患者19例；TNM臨床分期中，Ⅰ期患者11例Ⅱ期10例，Ⅲ期16例，Ⅳ期期患者3例。40患者中男性患者26例，女性患者14例，年齡39～78歲，平均（55.3±3.5）歲。另選取同期進(jìn)行健康體檢的40例人群為對(duì)照組，男25例，女15例，年齡41～76歲，平均（50.1±2.9）歲，兩組人員均自愿進(jìn)行本次檢測(cè)。兩組人員年齡、性別構(gòu)成比等基本信息納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件中分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采樣 抽取清晨空腹靜脈血5ml，離心機(jī)進(jìn)行10min 3000r/min離心，吸取上層血漿轉(zhuǎn)至無(wú)菌EP管中，然后在4℃12000r/min 下離心10min，吸取上清液置于-80℃冰箱中保存，以上操作在2h內(nèi)進(jìn)行完畢。

1.2.2 提取血漿游離DNA 采取QIAamp DNA Blood Midi Kit試劑盒按照說(shuō)明書(shū)提取DNA。取血漿樣本500ul，依次調(diào)節(jié)50ul蛋白酶、500ul Buffer AL 以及500ul乙醇，最后加入50ul的Buffer AE進(jìn)行洗脫，將提取的血漿游離DNA置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血漿游離DNA水平測(cè)定 上游引物為5/-CCACACTGTGCCCATCTACG-3/，下游引物為5/-AGGATCTTCATGAGGTA GTCAGTCAG-3/，擴(kuò)充產(chǎn)物為99bp長(zhǎng)度，上海工生物工程技術(shù)服務(wù)公司提供引物序列、將DNA模板以及樣品分別配置RT-PCR反應(yīng)體系，總反應(yīng)體系為20ul，熒光PCR反應(yīng)液為11ul，上下引物各1ul，DNA模板為1ul ddH2O 6ul，循環(huán)參數(shù)設(shè)置為95℃1min，95℃20s，60℃30s，68℃ 45s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[2]使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線，已知濃度獲得的ct與DNA含量為對(duì)數(shù)關(guān)系，采取PCR自帶分析軟件根據(jù)樣品ct獲得相關(guān)濃度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 患者與正常人之間血漿DNA水平比較

正常人群的血漿DNA水平值為（12.06±3.85）ng/ml，患者水平為（201.56±83.66）ng/ml,組間差異顯著（t=19.68,P=0.000）。

2.2 NSCLCA患者之間的血漿DNA水平比較

非小細(xì)胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平低于Ⅲ/Ⅳ期（P＜0.05），其他因素之間水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表。

表 NSCLCA患者之間的血漿DNAS水平值比較（±s，ng/ml）

表 NSCLCA患者之間的血漿DNAS水平值比較（±s，ng/ml）

資料血漿DNA水平tP性別男192.33±80.230.0390.065女201.23±97.65年齡（歲）≥60194.65±87.650.0450.061＜60205.66±89.66病理類(lèi)型腺癌205.33±80.230.0210.085鱗癌199.68±81.23分期Ⅰ/Ⅱ170.23±71.223.1970.000Ⅲ/Ⅳ229.66±93.56

3.討論

對(duì)于肺癌患者而言，手術(shù)仍是治療最佳選擇，但由于非小細(xì)胞肺癌起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)處于晚期，失去手術(shù)最佳機(jī)會(huì)。隨著醫(yī)療模式發(fā)展，新型化療藥物以及免疫抑制劑治療水平獲得明顯提高，使得肺癌患者治療方式出現(xiàn)更多選擇，但肺癌患者5年生存率僅為15%左右，總體效果不理想[3]。因此對(duì)于非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行早期篩查并盡早治療為最佳手段。

近年來(lái)腫瘤標(biāo)記物在腫瘤疾病診斷中獲得廣泛應(yīng)用，與影像學(xué)和病理學(xué)等見(jiàn)檢查方式比較，腫瘤標(biāo)記物檢查具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉以及預(yù)測(cè)效果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。游離DNA是一種含有DNA雙螺旋系統(tǒng)的核苷酸片段，臨床研究顯示其是可能與多系細(xì)胞的凋亡相關(guān)，因此可通過(guò)該物質(zhì)的水平值預(yù)測(cè)體內(nèi)細(xì)胞凋亡情況[4]，因此可通過(guò)其水平值預(yù)測(cè)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞情況。本次研究中，健康人群體內(nèi)血漿DNA水平值顯著低于非小細(xì)胞肺癌患者，患者的水平值高于正常人群可能是由以下原因造成：腫瘤細(xì)胞的凋亡或者壞死；腫瘤細(xì)胞自身釋放DNA；腫瘤細(xì)胞或者微轉(zhuǎn)移灶產(chǎn)生。以上產(chǎn)生的DNA進(jìn)入血漿后導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏高。以上結(jié)果提示，后續(xù)早期非小細(xì)胞癌患者中可使用檢測(cè)血漿DNA水平判斷患者是否具有疾病，如水平值高于正常的10倍以上可懷疑為該疾病，應(yīng)進(jìn)行下一步檢查。非小細(xì)胞肺癌患者中Ⅰ/Ⅱ水平值低于Ⅲ/Ⅳ期，其他因素之間水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明血漿DNA水平值可判斷非小細(xì)胞肺癌患者疾病發(fā)展階段，但對(duì)于疾病類(lèi)型以及誘發(fā)疾病的危險(xiǎn)因素?zé)o預(yù)測(cè)價(jià)值，本次研究結(jié)果與前人報(bào)道基本一致。經(jīng)以上結(jié)果分析我們認(rèn)為：血漿游離DNA在非小細(xì)胞肺癌疾病診斷及臨床發(fā)展分析中均具有指導(dǎo)價(jià)值，但目前研究處于初級(jí)階段，該水平因子的檢測(cè)仍有具有一定局限性，臨床實(shí)際應(yīng)用中需要聯(lián)合其他指標(biāo)開(kāi)展分析，提高診斷準(zhǔn)確性。