有機物對連續流Anammox脫氮及微生物群落影響

陳重軍,汪瑤琪,姜 瀅,郭萌蕾,謝嘉瑋,謝軍祥,沈耀良,2,3

有機物對連續流Anammox脫氮及微生物群落影響

陳重軍1,2,3,4,汪瑤琪1,姜 瀅1,郭萌蕾1,謝嘉瑋1,謝軍祥1,沈耀良1,2,3

(1.蘇州科技大學環境科學與工程學院,江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省環境科學與工程重點實驗室,江蘇 蘇州 215009；3.江蘇水處理技術與材料協同創新中心,江蘇 蘇州 215009；4.江蘇省厭氧生物技術重點實驗室,江蘇 無錫 214122)

采用UASB連續流反應器,研究了不同有機物濃度對厭氧氨氧化的脫氮性能及微生物群落結構的長期影響,結果表明,在COD濃度分別為0,20,40,60和80mg/L時,40mg/L COD濃度條件下對厭氧氨氧化反應的促進程度最大,TN和COD去除率穩定在88.5%和75.3%.在低濃度COD(20mg/L)條件下,厭氧氨氧化反應受影響程度不明顯,而COD為60和80mg/L時,系統脫氮性能受到不同程度的抑制.通過高通量測序技術對不同COD濃度下的微生物群落結構進行分析,結果表明不同COD濃度下,綠曲撓菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等占據主導,且隨著COD濃度從0增至80mg/L,浮霉菌門相對豐度從24.60%降至7.70%,其中的屬降幅最大,豐度從12.14%減至3.63%,變形菌門相對豐度從15.40%增至36.30%,其中菌屬的增幅最大,豐度從0.01%增至8.39%.

厭氧氨氧化；有機物濃度；脫氮性能；微生物群落結構；高通量測序

厭氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation, Anammox) 反應是指在厭氧或者缺氧條件下,厭氧氨氧化菌以NO2--N為電子受體,氧化NH4+-N為氮氣的生物過程[1-3].相比傳統硝化-反硝化工藝,該過程可降低50%的曝氣量、100%的有機碳源以及90%的運行費用[4],且污泥產率低.以厭氧氨氧化為主體的污水處理工藝研究和開發,給我國目前污水處理面臨的低碳氮比廢水脫氮難、能耗高、污泥產量大等問題帶來了曙光.然而,實際廢水中存在有機物,較高濃度的有機物存在會對厭氧氨氧化反應造成不利影響,甚至受到抑制.研究表明,當COD/N超過1.7或COD濃度超過100mg/L,將會嚴重抑制厭氧氨氧化反應器的性能,且隨著COD濃度的增加,anammox菌的比例會下降[5-6].有機物與厭氧氨氧化系統接觸時間的長短會對厭氧氨氧化反應產生不同的作用[7],特別是在長期有機物脅迫下,會對反應器效能及微生物群落結構造成重要影響[8].然而,關于在連續流反應器內有機物長期作用下的脫氮規律變化、厭氧氨氧化恢復情況及污泥微生物群落動態變化的研究報道尚少.

本文以乙酸鈉作為有機物,采用UASB連續流反應器,通過調控不同濃度的乙酸鈉控制進水中COD濃度,通過長期有機物脅迫研究,探究有機物在連續流反應器內對厭氧氨氧化效能影響和恢復情況,并初步明確其微生物群落結構的變化規律,旨在為厭氧氨氧化的實際應用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 實驗裝置和條件

實驗裝置采用UASB反應器,由有機玻璃制成,反應區的內徑8cm,沉淀區內徑10cm,高127.40cm,持水高度119.90cm,有效容積為19.70L.反應器依靠外層的水浴夾套保持溫度在(32±1)℃,整體用黑色遮陽塑料膜蓋住避光,并通過蠕動泵控制進水,反應器構造見圖1.

圖1 UASB反應器示意

1. 集氣管;2. 三相分離器;3. 出水口;4. 水浴加熱出水口;5. 取樣口;6. 進水口;7. 蠕動泵;8. 進水管;9. 水浴加熱進水管;10. 水浴加熱進水口

1.2 實驗用水和運行條件

實驗用水采用人工配水,UASB反應器運行維持進水NH4+-N和NO2--N濃度分別為114,150mg/L. 每個階段提升進水COD濃度分別為20, 40, 60和80mg/L,水質穩定后回降COD為0mg/L進行恢復,具體運行狀況見表1.進水pH值控制在7.5±0.5,添加KH2PO40.03g/L,MgSO40.30g/L,CaC120.18g/L, KHCO30.50g/L,1L配水添加1mL微量元素I,II,微量元素I,II配比見文獻[9],整個運行周期為157d.

表1 UASB反應器運行工況

1.3 測試項目與方法

每隔2d采集反應器進出水,測定NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD濃度,NH4+-N:納氏試劑分光光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N:紫外分光光度法;COD采用重鉻酸鉀法[10].

微生物測試樣品共計5個,分別取自研究開始前和COD濃度分別為20,40,60,80mg/L時穩定運行的反應器內混合污泥,5個樣品編號為C0、C20、C40、C60和C80.采用Illumina Misep測序平臺對5個樣品中的微生物進行測序分析,包括DNA提取、PCR擴增、Miseq文庫構建和Miseq測序[11],微生物測序過程委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成.

2 結果與討論

2.1 有機物對厭氧氨氧化反應器水質的長期影響分析

4個階段反應器氮素和COD的濃度變化情況見圖2~4.第一階段,向穩定運行300多天的厭氧氨氧化反應器內添加20mg/LCOD后,初始幾天NO2--N和NH4+-N的去除情況稍有波動,隨后穩定, NO3--N累積量均值由21.88mg/L減少至8.75mg/L.但與未添加COD的運行狀況相比,總氮去除率未出現明顯變化,保持在85%左右,即20mg/LCOD的加入對厭氧氨氧化系統并無顯著影響.該階段中COD的平均去除率為42.8%.待反應器內氮素變化穩定后,停止添加有機物以恢復厭氧氨氧化脫氮系統.恢復期間反應器內脫氮菌種經歷了適應期和穩定期,出水氮素在停止投加COD的前4d變化較大,之后逐步穩定.

圖2 不同有機物濃度下氮素的變化情況

圖3 不同有機物濃度下COD的變化情況

第二階段,向進水中投加40mg/L的COD,該階段氮素平均去除率為88%,高于第一階段的85%,出水中NO2--N和NH4+-N剩余量均值為4.21mg/L和1.80mg/L,NO3--N的累積量減至7.48mg/L.與氮素去除率提高一致,COD去除率升高至75.3%,表明反應系統厭氧氨氧化菌和其他脫氮功能菌共存,共同協作提升氮素和碳素的去除率[12].隨后停止添加有機物,反應器進入第二階段的恢復期.

第三階段,繼續增大進水COD濃度至60mg/L,出水NO2--N和NH4+-N濃度逐漸升高,穩定后平均去除率降至84.4%和80.3%,TN去除率降至73.2%, COD去除率也相應降至60.0%,表明COD為60mg/L時已經對厭氧氨氧化反應產生抑制作用.待氮素去除穩定后,停止有機物投加,初始幾天氮素和碳素去除率變化不大,可能是反應器內殘留一定的有機物,隨后出水NO2--N和NH4+-N濃度逐漸降低.然而,由于該階段厭氧氨氧化系統受有機物影響,反應器運行狀況未回歸至第一階段前.

圖4 不同有機物濃度下氨氮和亞硝酸鹽氮去除率的變化情況

第四階段,繼續提高進水有機物濃度至COD為80mg/L,經過短暫的適應期后,反應器出水迅速惡化,出水NO2--N和NH4+-N濃度逐漸增加,分別由第四階段初的7.64,18.06mg/L升至78.61,59.31mg/L,TN去除率降至50%.碳素和氮素的去除情況類似,COD的去除率下降至35.5%,表明該階段厭氧氨氧化反應受到較為嚴重的抑制.為減少對反應器內的厭氧氨氧化菌的抑制,在投加80mg/LCOD后的第16d開始,停止投加有機物,進行反應器的性能恢復試驗.與前三個階段的恢復期相比,該階段恢復期較長.

低濃度有機物的加入對厭氧氨氧化反應影響不大或無明顯影響,高濃度對其有抑制或毒性作用,介于兩種情況間可能存在對其促進作用最佳的有機物濃度[13-14].朱葛夫等[15]采用CSTR厭氧氨氧化反應器,發現COD濃度小于120mg/L時可促進厭氧氨氧化反應,但高于200mg/L時產生抑制效果.管勇杰等[16]考察乙酸鈉對ASBR反應器內厭氧氨氧化的影響,表明厭氧氨氧化活性在COD濃度為80mg/L時達到最大值.操沈彬等[17]通過批次試驗說明當NO2--N濃度為35mg/L左右時,乙酸鈉濃度在200mg/L以下并不會對厭氧氨氧化系統有沖擊影響,且一定程度上促進了厭氧氨氧化反應.也有研究表明,當有機碳源質量濃度大于110mg/L時,會抑制厭氧氨氧化反應[18].本研究中40mg/L的COD是UASB反應器內對厭氧氨氧化反應有促進影響效果的最佳濃度值,低于其他學者的研究結果,推測可能是反應器類型、接種污泥不同等造成的,再加上本試驗UASB反應器長期培養厭氧氨氧化污泥,試驗開始前污泥中厭氧氨氧化菌占總細菌比例高達31.40%,其他脫氮功能菌占比較少,造成異養菌不能消耗掉大量有機物而為厭氧氨氧化菌生存提供有利條件.

2.2 有機物對厭氧氨氧化反應器微生物群落結構的影響分析

2.2.1 各濃度下微生物豐度和多樣性分析 樣品C0、C20、C40、C60和C80序列數均在30087~36891間,有機物脅迫下對序列數變化影響不大(表2). Chao和ACE指數表示樣品微生物群落豐富度,值越大代表物種總數越多;Shannon指數反映了基于物種數量的群落種類多樣性,指數越大表明群落的復雜程度越高;Simpson指數體現了優勢物種生物量占群落生物總量的比重,該指數越大表明優勢菌群生物量占總生物量比重越大[19].由此,樣品C40所含微生物種類較其他樣品少,優勢菌群占比大,也就是說添加40mg/L的COD,反應器內微生物種群復雜度降低,功能優勢菌群占比突出.

表2 UASB反應器污泥細菌豐度變化情況

2.2.2 各COD濃度下微生物門分類水平的相對豐度變化 各COD濃度下污泥樣品微生物在門豐度上占比較多的依次為綠曲撓菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)和放線菌門(Actinobacteria),表明加入有機物后反應器內主要菌群種類并未改變,僅在優勢占比上有所變動(圖5).其中,綠曲撓菌門常在厭氧氨氧化反應器中檢出,具有固碳功能,能將CO2固定為丙酮酸,但在厭氧氨氧化反應器中承擔何種角色還未可知[20-21].反應器中脫氮功能菌為變形菌門和浮霉菌門,而厭氧氨氧化菌主要存在于浮霉菌門中,浮霉菌門在所有細菌數目中的占比可反映出厭氧氨氧化菌的生存狀態.

圖5 各COD濃度下細菌在門層面上的群落組成變化情況

隨著有機物濃度的增加,浮霉菌門的相對豐度總體呈現降低趨勢,而變形菌門相對豐度逐漸增高(圖6).當反應器進水基質中未添加有機物時,浮霉菌門相對豐度占比高達24.60%,是厭氧氨氧化反應系統內絕對優勢菌群.當COD濃度增至20,40mg/L時,浮霉菌門的相對豐度減小,變形菌門相對豐度有增長趨勢,但幅度變化不大,均在15%左右波動.有機物濃度持續增大,兩種脫氮功能菌所占百分比差異不斷增大,變形菌門成為反應器優勢種群,浮霉菌門在有機物的影響下受到抑制,其中當COD=80mg/L時,浮霉菌門占比銳減至7.70%,而變形菌門增至36.30%.有機物濃度的增高,會直接影響厭氧氨氧化反應器內微生物的群落結構,且抑制浮霉菌門微生物的生長.有機物的加入打破了厭氧氨氧化菌作為優勢菌的地位,有機物加入促使反硝化菌數量增加[22-23].本研究當COD濃度為20mg/L時,厭氧氨氧化反應的脫氮功能無明顯影響,而厭氧氨氧化菌所在的浮霉菌門豐度已減至9.80%,可能是因為反應器內污泥含量較多,菌體基數較大,對反應基質中的氮素去除影響并不明顯.而當COD濃度為40mg/L時,變形菌門和浮霉菌門相對豐度占比未有明顯變化,但氮素去除率從85.1%增至88.5%,反應器內細菌種群類別減少,復雜度降低,這與表2的結果相對應.然而,當COD濃度增至60mg/L以上,變形菌門利用系統內的有機物快速增殖,消耗基質,雖然浮霉菌門相對比例有所上升,但推測一定程度上抑制了浮霉菌門的活性,造成TN去除率降低.

圖6 各COD濃度下浮霉菌門和變形菌門占比變化情況

2.2.3 各COD濃度下微生物屬分類水平的相對豐度變化 將主要脫氮功能菌浮霉菌門和變形菌門下的菌群進行屬層面上的分析,見圖7.浮霉菌門中占比較多的為、和SM1A02,均為常見的種屬[24-25].屬以亞硝酸為能源,以CO2為碳源,最早是在荷蘭的污水處理廠污泥中發現的,是第一個被富集鑒定的ANAMMOX菌種[26].與屬一致,屬以CO2為唯一碳源,通過氧化 NO2--N為 NO3--N獲得能量,最初是在德國斯圖加特廢水處理滴濾池中發現的[27].隨著有機物濃度的增大,屬豐度一直呈現下降趨勢,所占百分比從12.14%降至3.63%,但卻一直是浮霉菌門中的主導菌屬,可能是因其是生物進化策略中的R型策略者,擁有更高的生長率[28].而其他三種菌屬均呈現先下降后小幅度升高最后又降低的趨勢. 4種菌屬中SM1A02占比變化最小,表明有機物濃度對SM1A02菌屬的豐度影響最小.

變形菌門中、Unclassfied、、和菌屬是所有菌屬中比例較大的5類菌.蛭弧菌()一般具有噬菌的特性,但在厭氧氨氧化反應器內的作用還需進一步研究.伯克氏菌屬()廣泛存在于自然環境中,一般在高溫環境中被檢測到,本文研究裝置置于(32±1)℃,為該菌的生長提供了適宜條件[29].具有反硝化性能,在有機碳源存在的厭氧環境中常被檢測到[30].叢毛單胞菌科()異養菌,可以降解有機物,有機物增加會提升其相對豐度[31].假單胞菌屬()大部分有機化能異養菌,呼吸代謝,也有兼性化能自養菌,能利用H2或CO2作為能源.分子氧是普遍的電子受體,部分能利用硝酸鹽作為電子受體進行反硝化[31].其中菌屬增幅最大,其豐度從未添加有機物時的0.01%增至COD=80mg/L時的8.39%,而菌屬是在反應器氮素去除效果最好的時候比例減至最低(1.89%),其他菌屬變化規律尚不明顯,具體原因還有待進一步研究.

圖7 各COD濃度下浮霉菌門和變形菌門的群落組成(屬)相對百分比

3 結論

3.1 在40mg/L COD濃度條件下對厭氧氨氧化反應的促進程度最大,TN和COD去除率穩定在88.5%和75.3%.在低濃度COD(20mg/L)條件下,厭氧氨氧化反應受影響程度不明顯,而COD為60,80mg/L時,系統脫氮性能受到不同程度的抑制.

3.2 通過高通量測序技術對不同COD濃度下的微生物群落結構進行分析,結果表明不同COD濃度下,綠曲撓菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等占據主導,且隨著COD濃度從0升至80mg/L,浮霉菌門相對豐度從24.60%降至7.70%,其中的屬降幅最大,豐度從12.14%減小至3.63%,變形菌門相對豐度從15.40%增至36.30%,其中菌屬的增幅最大,豐度從0.01%增至8.39%.

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Effects of organic matter on nitrogen removal and microbial community in anammox reactor.

CHEN Chong-jun1,2,3,4, WANG Yao-qi1, JIANG Ying1, GUO Meng-lei1, XIE Jia-wei1, XIE Jun-xiang1, SHEN Yao-liang1,2,3

(1.School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory of Environmental Science and Engineering, Suzhou 215009, China；3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009, China；4.Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Wuxi 214122, China)., 2019,39(12)：5049~5055

The UASB continuous flow reactor was used to study the long-term effects of different organic concentrations on the anammox nitrogen removal and microbial community structure. The results showed that the 40mg/L of COD concentration provided the most promotion to anammox reaction among the COD concentration levels with 0, 20, 40, 60 and 80mg/L. At this concentration, the TN and COD removal rates were stabilized at 88.5% and 75.3%, respectively. Under a lower level (20mg/L), the anammox reaction was not affected significantly. However, the nitrogen removal performance was inhibited when the COD concentrations were higher at 60 and 80mg/L. The microbial community structure under different COD concentrations was analyzed by high-throughput sequencing technology. The results indicated that the Chloroflexi, Planctomycetes, Proteobacteria and Actinobacteria were always dominated under different COD concentrations, their relative abundance varied in different scenarios. The relative abundance of Planctomycetes was decreased from 24.60% to 7.70% with the increase of COD concentration (0 to 80mg/L). Among them,declined fastest, and the abundance was decreased from 12.14% to 3.63%. The relative abundance of Proteobacteria was increased from 15.40% to 36.30%, among whichhad the biggest increase from 0.01% to 8.39%.

anammox；organic matter concentration；nitrogen removal；microbial community；high throughput sequencing

X703

A

1000-6923(2019)12-5049-07

陳重軍(1984-),男,浙江義烏人,蘇州科技大學環境科學與工程學院副教授,主要從事廢水生物處理技術與機制研究.發表論文50余篇.

2019-05-16

國家自然科學基金項目(51508366,51308367);江蘇省環境科學與工程重點實驗室開放基金(Zd1804);江蘇省厭氧生物技術重點實驗室開放基金(KFLAB201701)

* 責任作者, 副教授, chongjunchen@163.com