石斛西洋參景天姜膠囊安全性及緩解體力疲勞功能研究

朱雪峰 ，嚴 婷 ，李世芬 ，胡 奇 ， 張成香

（1.南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，江蘇南京 211166；2.江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評價與研究中心，江蘇南京 211166）

鐵皮石斛屬蘭科石斛屬植物，新鮮或干燥莖，為藥食兩用[1]，具有很好的抗衰老、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力的功效，并且可用于腫瘤、糖尿病、慢性咽炎、胃炎、機體免疫下降等的輔助治療[2-4]。西洋參為五加科植物，根味苦、微甘、性寒，為珍貴藥材[5]，現(xiàn)代研究表明，西洋參含有多種人參皂苷、維生素及微量元素等生理活性物質，具有增強抗疲勞能力、耐高溫能力、抗腫瘤作用、降血脂作用、抗氧化作用、免疫調節(jié)作用、改善老年高血壓患者的低舒張壓情況等功效[6-9]。紅景天為景天科紅景天屬草本或亞灌木植物[10]，具有增強人體免疫力、抗衰老、抗輻射、保護心腦血管等功效[11-13]。干姜為姜科植物姜的干燥根莖，是常用的藥食同源中藥材，化學成分主要包括揮發(fā)油和姜辣素類成分，具有極好的藥用價值。目前為止，對鐵皮石斛、西洋參、紅景天和干姜的單一組分或2種組分聯(lián)合的研究報道較多[1-12]，但未見對這4種藥材配伍混合物的研究報道，試驗以這4味藥材提取物和輔料按照一定的工藝混合制成的膠囊為受試物進行安全性毒理學和功能研究，以期為石斛西洋參景天姜膠囊口服的安全性和功能性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試物

石斛西洋參景天姜膠囊，該膠囊內容物主要包括鐵皮石斛、西洋參、紅景天、干姜提取物及輔料。于陰涼避光處保存，供試驗備用。人體推薦攝入量為2.4 g/人/日。

1.1.2 試驗動物及飼料

急毒試驗用動物為健康成年SPF級ICR小鼠20只，雌雄各半，南京醫(yī)科大學醫(yī)藥實驗動物中心提供；微核試驗和小鼠精子畸形試驗選用清潔級ICR健康小鼠，揚州大學比較醫(yī)學中心提供；30 d喂養(yǎng)試驗用動物為SPF級健康離乳SD大鼠80只、功能試驗用動物為SPF級CI/F1代健康雄性小鼠160只，雌雄各半，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，試驗動物在屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)；輻照鼠用滅菌飼料，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司提供。

1.1.3 儀器、菌株和試劑

T-1000型電子天平、JJ-100型電子天平、離心機、OLYMPUS型顯微鏡、日立7100型全自動生化分析儀、SIEMENS ADVIA 2120i型血液分析儀、離心機、水浴鍋、多功能酶標儀、BIOSEN C＿Line GP+葡萄糖/乳酸分析儀、游泳箱（大小約50 cm×50 cm×40 cm）。鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102 來源于 Molecular Toxicology，Inc.；S-9來源于江蘇齊氏生物科技有限公司；血漿尿素試劑盒、肝糖原試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

用最大耐受量法開展小鼠急性毒性試驗，設計劑量為 15 000 mg/kg·bw。

1.2.2 Ames試驗方法

采用標準平板摻入法，選鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97，TA98，TA100，TA102，經(jīng)鑒定合格后開展試驗。在加與不加S-9的情況下以5 000，1 000，200，40，8 μg/皿劑量進行試驗，每個劑量3個平皿。同時設陽性、陰性對照組。以上試驗過程重復1次。

1.2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

25～30 g的ICR清潔級小鼠50只，雌雄各半，按體重隨機分為5個組，每組10只。設1 250，2 500，5 000 mg/kg·bw 3個劑量組、陰性對照組（無菌水，20 mL/kg·bw灌胃） 和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg·bw腹腔注射）。采用30 h給受試物法，2次給樣間隔24 h，第2次給樣6 h后處死動物，取小鼠胸骨骨髓常規(guī)制片、鏡檢，計數(shù)1 000個骨髓嗜多染紅細胞（PCE） /每支動物，計算微核發(fā)生率。計數(shù)200個嗜多染紅細胞時所觀察到的成熟紅細胞數(shù)（NCE） /每只動物，計算PCE/NCE。

1.2.4 小鼠精子畸形試驗

ICR清潔級雄性小鼠25只，分為5組，每組5 只。設 1 250，2 500，5 000 mg/kg·bw 3 個劑量組、陰性對照組（無菌水，20 mL/kg·bw灌胃） 和陽性對照組（環(huán)磷酰胺，40 mg/kg·bw腹腔注射）。給樣每天1次，連續(xù)5 d。于第1次給樣后的第35天處死動物，取兩側附睪精子濾液制片、鏡檢。每只動物計數(shù)1 000個精子（結構完整），計算精子畸形發(fā)生率。

1.2.5 反復染毒試驗方法

SPF級健康離乳SD大鼠80只，雌雄各40只，分為4組，每組20只。按人體推薦劑量的30，65，100 倍設 3 個劑量組 （1.2，2.6，4.0 g/kg·bw/d），另設一個空白對照組0 g/kg·bw/d，連續(xù)給樣30 d。每周測1次動物體重和2次食物攝入量，計算食物利用率。30 d后，隔夜禁食，麻醉，取血測其血液學指標和血液生化指標，摘取肝、腎、脾、睪丸和卵巢稱重，計算臟體比。選取對照組和高劑量組肝、脾、腎、胃、十二指腸、睪丸和卵巢制作病理切片進行組織病理學檢查。

1.2.6 緩解體力疲勞功能試驗方法

以0.20，0.40，1.20 g/kg·bw/d 3個劑量經(jīng)口給予小鼠1個月，測小鼠的負重游泳時間、血漿尿素水平、肝糖原儲備量及血乳酸值。若負重游泳試驗結果陽性，且血乳酸、血漿尿素、肝糖原3項生化指標中任2項指標陽性，即可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞作用。

（1） 負重游泳時間。最后一次給小鼠受試物30 min后，置于游泳箱中游泳，水深約35 cm，水溫25±1℃，鼠尾根部負荷5%體重的鉛絲。記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，作為小鼠負重游泳時間。末次給小鼠受試物30 min后，在溫度為30℃的水中不負重游泳90 min，休息60 min后立即眼眶采血。血液離心后，吸取20 μL血漿，用二乙酰一肟法測定血漿尿素值。

（2） 血漿尿素水平。最后一次給動物受試物30 min后，處死取肝臟，稱取75 mg，加堿溶液0.225 mL，煮沸20 min，配成1%肝勻漿液，取1%肝勻漿液0.1 mL，加2 mL蒽酮試劑，煮沸5 min，冷卻后于波長620 nm處比色測定，計算肝糖原含量。

（3） 肝糖原儲備量及血乳酸值。末次給動物受試物30 min后眼眶靜脈采血。不負重游泳（水溫30℃）10 min后停止，立即眼眶靜脈采血，休息20 min后再采血，測定動物血乳酸含量。葡萄糖/乳酸分析儀測定乳酸方法：取血10 μL并轉移到反應試管中，蓋緊蓋子振蕩混勻，從分析儀上讀數(shù)。

血乳酸曲線下面積用下式表示：

血乳酸曲線下面積＝1/2×(游泳前血乳酸值＋游泳后0 min的血乳酸值)×10+1/2×（游泳后0 min的血乳酸值+游泳后休息20 min的血乳酸值）×20.

1.2.7 統(tǒng)計學分析

微核試驗結果采用Poisson分布U檢驗進行統(tǒng)計處理，小鼠精子畸形試驗結果采用秩和檢驗進行統(tǒng)計處理。30 d喂養(yǎng)試驗和小鼠功能試驗對各試驗原始數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足方差齊要求的數(shù)據(jù)資料用單因素方差分析方法中多個試驗組與一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計處理；對方差不齊的數(shù)據(jù)資料采用秩和檢驗進行統(tǒng)計處理。

2 結果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

動物未觀察到異常，MTD大于15 000 mg/kg·bw，無毒級。

2.2 Ames試驗結果

各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過陰性對照組的2倍，受試物對鼠傷寒沙門氏菌 TA97，TA98，TA100，TA102這4株試驗菌株，在加與不加S-9時，均未見有致基因突變作用。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

小鼠骨髓細胞微核試驗結果見表1。

表1 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

由表1可見，各劑量組微核率與陰性對照組比較無顯著性差異 （p＞0.05）。受試物各劑量組的PCE/NCE比值與對照組的差異均在對照組20%以內，受試物對骨髓細胞增殖沒有抑制作用。說明受試物對小鼠骨髓細胞（骨髓多染細胞）無誘發(fā)微核作用。

2.4小鼠精子畸形試驗結果

小鼠精子畸形試驗結果見表2。

表2 小鼠精子畸形試驗結果

由表2可見，各劑量組精子畸形率與陰性對照組比較，無顯著性差異（p＞0.05），受試物對小鼠精子畸形率未產(chǎn)生影響。

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗結果

各組大鼠未見明顯異常表現(xiàn)和行為，未觀察到中毒體征和死亡。雌、雄性大鼠各劑量組各觀察點的體重、食物利用率、血液學、血生化、臟器絕對質量及相對質量與0 g/kg·bw/d組比較，均無異常。

大體解剖學檢查各劑量組的肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸、卵巢等未見異常改變；鏡檢結果顯示，空白對照組和高劑量組除了各有1例輕度肝脂肪變性外，無其他異常改變。因大鼠自然群體中有一定概率的肝脂肪會發(fā)生變性，結合空白對照組和高劑量組均有1例，故試驗中肝脂肪變性被判斷為非受試物引起。

2.6 緩解體力疲勞功能試驗

0.40，1.20 g/kg·bw/d組小鼠負重游泳時間長于0 g/kg·bw/d組；各組血漿尿素水平與0 g/kg·bw/d組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）；而各組的肝糖原儲備量高于0g/kg·bw/d組，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；0.40，1.20 g/kg·bw/d 組小鼠游泳后血乳酸曲線下面積值低于0 g/kg·bw/d組，差異有統(tǒng)計學意義 （p＜0.05）。

表3 小鼠緩解體力疲勞功能試驗結果（x±s）

3 結論

為探討石斛西洋參景天姜膠囊的食用安全性和緩解體力疲勞功能，研究從急性經(jīng)口毒性試驗、30 d喂養(yǎng)試驗、遺傳毒性試驗和小鼠緩解體力疲勞功能試驗4個角度開展。結果表明，石斛西洋參景天姜膠囊對小鼠急性經(jīng)口毒性試驗的MTD大于15 000 mg/kg·bw，屬無毒級。遺傳毒性試驗中，Ames試驗、小鼠微核試驗和精子畸形試驗均未檢測到致突變作用。30 d喂養(yǎng)試驗以1.2，2.6，4.0 g/kg·bw/d的劑量給予大鼠30 d，各項指標均未檢測到毒性作用。小鼠功能試驗結果表明，石斛西洋參景天姜膠囊具有緩解體力疲勞作用。即試驗條件下，石斛西洋參景天姜膠囊安全性良好，具有緩解體力疲勞功能。