基于網(wǎng)絡藥理學的木瓜藥理功能定位及作用機制分析

李 娜，趙巖巖，周 威，張 浩，胡梁斌，莫海珍，李紅波，3

（1.河南科技學院食品學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學院生命科學技術(shù)學院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州 450001）

木瓜屬薔薇科（Chaenomeles sinensis(Thouin)Koehne），在我國已有3 000多年的栽培歷史。作為我國衛(wèi)生部2002年公布87個的藥食同源名單之一，木瓜含有豐富的營養(yǎng)成分。鑒于重要的藥用價值和廣闊的市場應用前景，有必要對其活性成分進一步研究和開發(fā)利用。目前，大部分食品活性研究采用了分離純化和鑒定，對某一組分進行活性測定。這一研究策略忽視了食品作為一個整體對機體產(chǎn)生的作用。網(wǎng)絡藥理學將藥物作用相關(guān)的靶點蛋白納入一個龐大的生物信息學數(shù)據(jù)庫中，從分子水平分析藥物發(fā)揮作用的潛在信號通路和作用機制[1]。劉方等人[2]通過網(wǎng)絡藥理學分析了柿果主要活性成分靶點，發(fā)現(xiàn)這些靶點主要作用于心血管疾病、神經(jīng)精神性疾病。呂金燕等人[3]通過構(gòu)建羅漢果止咳化痰病的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡模型，解析了羅漢果主要活性成分與止咳化痰靶點的作用方式。蘇比努爾·巴克等人[4]采用網(wǎng)絡藥理學虛擬篩選的方法，探討了桑椹多成分協(xié)同防治糖尿病的藥理作用及機制。

借鑒網(wǎng)絡藥理學研究思路，構(gòu)建木瓜活性成分-靶點網(wǎng)絡，對其靶點進行功能富集及通路分析，為從分子水平研究木瓜作用機制提供理論基礎，也為從整體上把握食品的功能活性研究提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 木瓜化合物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）查找并收集木瓜的潛在活性成分[5]，根據(jù)藥動學參數(shù)口服生物利用度（Oral bioavailability，OB） 和藥物相似性 （Drug-likeness，DL） 獲取木瓜主要活性成分，通過ChEMBL（www.ebi.ac.uk/chembl）和PubChem Database（www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）等化學成分數(shù)據(jù)庫檢索木瓜化學成分的分子結(jié)構(gòu)，構(gòu)建木瓜小分子化合物結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。

1.2 木瓜化合物潛在靶點預測及網(wǎng)絡構(gòu)建

利用Pharmmapper Server數(shù)據(jù)庫（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/）預測木瓜主要化合物靶點[6]，進一步使用 TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）和SymMap（http://www.symmap.org/）數(shù)據(jù)庫查詢驗證木瓜主要化合物靶點[7]，使用Cytoscape構(gòu)建木瓜化合物-靶點分子網(wǎng)絡，對其可視化分析。

1.3 木瓜作用靶點蛋白PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將篩選到的靶點合并去冗余，導入STRING數(shù)據(jù)庫，獲取靶點之間的相互作用數(shù)據(jù)，然后導入Cytoscape，構(gòu)建木瓜潛在作用靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，采用Analyze network工具對網(wǎng)絡進行分析，采用Generate style from statistics工具根據(jù)Degree值的大小設置靶點的大小和顏色。

表1 木瓜中主要化合物信息

1.4 GO富集分析和KEGG通路注釋分析

為研究化合物可能作用的生物學通路及靶點之間的相互關(guān)系，揭示靶點蛋白的相互作用關(guān)系及其在基因功能上的富集情況，將篩選到的分子靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析和代謝通路注釋分析[8]。使用Cytoscape，根據(jù)靶點分子的通路注釋結(jié)果構(gòu)建靶點分子-通路網(wǎng)絡圖，對其可視化分析，解析木瓜作用的生物通路。

1.5 靶點分子對接驗證

利用http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/在線網(wǎng)站對KCNA三維空間結(jié)構(gòu)進行模擬[9]；利用在線生物信息學網(wǎng)站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/，對其三維結(jié)構(gòu)模型進行綜合評價；利用Autodock軟件對該靶點蛋白與其互作的木瓜分子進行對接研究[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 木瓜中主要化合物分析

利用中藥系統(tǒng)藥理學技術(shù)平臺TCMSP平臺篩選出89個化合物，以OB≥30%和DL≥30%作為篩選條件得到20個主要活性成分。

木瓜中主要化合物信息見表1。

2.2 木瓜化合物-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

木瓜化合物-靶點網(wǎng)絡圖見圖1。

由圖1可知，木瓜化合物-靶點網(wǎng)絡共有199個節(jié)點，包含了20個化合物，179個靶點，其中內(nèi)圈為化合物分子，外圈為靶點分子，線條表示化合物與靶點的相互作用關(guān)系。該網(wǎng)絡由248條邊構(gòu)成一個完整的網(wǎng)絡，每條邊代表化合物和靶點的相互作用，平均節(jié)點度（degree） 為1.4，其中節(jié)點值排名靠前的化合物有槲皮素、丁香酚、甲基丁香酚、草蒿腦等，節(jié)點值分別為150，29，13，10。

圖1 木瓜化合物-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 木瓜作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

對木瓜化合物的潛在靶點進行合并去冗余后，共得到179個靶點蛋白。使用STRING數(shù)據(jù)庫，獲取179個靶點相互作用關(guān)系，然后導入Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建木瓜作用靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖。

木瓜化合物潛在靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖見圖2。

圖2 木瓜化合物潛在靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖

由圖2可知。網(wǎng)絡共包括176個節(jié)點，其中ENOX2，DIO1，DCAF5找不到與之相互作用的靶點蛋白。網(wǎng)絡共3051條邊，平均節(jié)點度為34.7，圖中節(jié)點越大表明其度值越大，其中Degree值排在前20的關(guān)鍵蛋白分別為AKT1，VEGFA，MYC，IL6，TNF，ESR1， MMP9， JUN， IL10， PTGS2， CDKN2A，HIF1A，RELA，PTEN，CASP3，SPP1，AR，CDKN1A，F(xiàn)OS，CXCL8，表明這些蛋白在網(wǎng)絡中中心度較高，能與更多的蛋白發(fā)生互作，是木瓜作用的主要靶標。

2.4 靶點GO富集分析和KEGG通路分析

為進一步闡明木瓜化學分子的作用機制，將預測到的179個靶點蛋白靶點進行GO富集分析和KEGG通路分析。結(jié)果表明，其主要作用于TNF信號通路（TNF signaling pathway）、甲型流感（Influenza A）、結(jié)核（Tuberculosis）、恰加斯病（Chagas disease）、弓形體病（Toxoplasmosis）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway） 等。

木瓜靶點-KEGG通路網(wǎng)絡圖見圖3。

圖3 木瓜靶點-KEGG通路網(wǎng)絡圖

靶點蛋白GO富集分析見圖4。

圖4 靶點蛋白GO富集分析

從分子功能（Molecular function）、細胞組成（Cellular component）和生物過程（Biological process）3個部分了解這些靶點蛋白GO生物學過程。其中分子功能主要集中在Binding（GO:0005488），Protein binding（GO:0005515），Ion binding（GO:0043167），Catalytic activity（GO:0003824），Organic cyclic compound binding（GO:0097159） 等；細胞組成上，與cell（GO:0005623），cell part（GO:0044464），intracellular（ GO:0005622） ， intracellular part（ GO:0044424），organelle（GO:0043226） 等相關(guān)性較大；此外，這些靶點主要參與了cellular process（GO:0009987），biological regulation （GO:0065007），response to stimulus（GO:0050896），regulation of biological process（GO:0050789） 等生物過程。

2.5 主要靶點AKT1與槲皮素分子對接

選取木瓜作用靶點蛋白PPI網(wǎng)絡分析結(jié)果中，Degree值最高的靶點 AKT1，利用 http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/網(wǎng)站對AKT1三維結(jié)構(gòu)進行模擬。利用在線生物信息學網(wǎng)站http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/，對AKT1三維結(jié)構(gòu)模型進行綜合評價。Ramachandran plot分析證明模擬的AKT1三維結(jié)構(gòu)合理，可以用于下一步分子對接。AKT1為木瓜活性成分槲皮素的潛在靶標，在ZINC數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org/）中下載木瓜槲皮素（Quercetin：ZINC3869685） 分子的sdf文件，利用Autodock軟件進行AKT1與槲皮素的對接研究。

木瓜槲皮素（Quercetin）與AKT1靶點蛋白分子對接圖見圖5。

圖5 木瓜槲皮素（Quercetin）與AKT1靶點蛋白分子對接圖

槲皮素可強有力作用于AKT1蛋白氨基酸殘基形成的疏水性口袋附近，能夠與AKT1蛋白以下位點以氫鍵方式結(jié)合：15位精氨酸、16位甘氨酸、18位酪氨酸、54位天冬氨酸、80位色氨酸、82位蘇氨酸、85位谷氨酸、87位蘇氨酸、187位絲氨酸、211位蘇氨酸、271位纈氨酸、274位天冬氨酸、295位亮氨酸和297位賴氨酸，這些結(jié)果一定程度上支持了前述預測的化合物和靶點分子互作的可靠性。

3 結(jié)論

木瓜在我國種植歷史悠久，栽培面積廣，分布于我國華中、華東、西南等地。其藥用價值也從古沿用至今，《本草綱目》即有“木瓜所主霍亂吐利轉(zhuǎn)筋、腳氣，皆脾胃病，非肝病也”的相關(guān)記載。但木瓜確切的藥理功能和作用機制尚缺乏深入研究。研究充分利用現(xiàn)有化合物及相關(guān)靶點數(shù)據(jù)庫，運用網(wǎng)絡藥理學對木瓜主要活性成分及其靶點進行分析研究，通過構(gòu)建木瓜分子化合物-靶點作用網(wǎng)絡，對木瓜相關(guān)靶點分子功能、細胞組成、生物過程和KEGG通路進行富集分析，最后通過分子模擬及分子對接進一步驗證了化合物和靶點分子互作的可靠性。研究揭示了木瓜多化合物、多靶點的生物學特點，為從分子水平研究木瓜作用機制提供理論基礎，也為整體上把握食品的功能活性研究提供一種新思路。