益生菌V9對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠肝功能、氧化應激及脂代謝的影響及作用機制①

李欣益 劉春妍 黃 建 顏 妍 謝基明 王玉珍

(內蒙古農業大學,呼和浩特 010018)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種較為普遍的慢性肝病，病理表現為脂肪變性和脂質沉積。由于肥胖，缺乏運動以及不健康的飲食習慣導致了NAFLD在全球范圍內的發病率呈現逐年上升趨勢[1,2]。NAFLD包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化，有的甚至可能發展為肝癌[3,4]。現有研究表明NAFLD的治療方法主要包括噻唑烷二酮類、二甲雙胍、鹽酸小柴堿等藥物性手段，但該類藥物的副作用較大，難以實現安全性的治療；而改善生活方式，培養科學的飲食，加強鍛煉等非藥物手段又難以實現高效的治療[5]。因此，探究更安全有效的治療方式成為關注的熱點。益生菌V9(Bifidobacterium animalis subsp.lactis V9)是從12位健康的蒙古族兒童糞便中分離得到31株雙歧桿菌中篩選出來的一株具備豐富益生活性的雙歧桿菌[6]。它具有抗炎和抗氧化、降低膽固醇和血壓、增強免疫力等功能[7]。在NAFLD的發病過程中，國外研究者提出的“二次打擊”學說已經成為解釋該病發生的主要理論，“一次打擊”主要是指胰島素抵抗以及脂質代謝紊亂造成肝細胞的變性；“二次打擊”是指在“一次打擊”的基礎上進行一系列的炎癥反應和氧化應激反應[8,9]。本實驗則以“二次打擊”為理論基礎，探究益生菌V9抑制NAFLD大鼠的氧化應激反應、緩解脂代謝紊亂，改善NAFLD大鼠的肝損傷情況。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與材料 120 g左右的Wistar雄性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，進行常規飼養，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h,保持溫度20～26℃，濕度40%～60%，隨意進食與飲水。高脂飼料含脂肪33.1%、普通飼料含脂肪11.4%，均由北京科奧協力飼料有限公司提供。

1.1.2主要試劑 益生菌雙歧桿菌V9由內蒙古農業大學“乳品生物技術與工程”教育部重點實驗室提供；黃連素購自阿拉丁試劑公司；MDA、SOD、TC試劑盒由南京建成生物工程有限公司生產；抗體分別為SOD2(編號：Lot#10002)，PPAR-γ(編號：LotNO.821800535)，β-actin(編號：Lot#4967S),均由美國Cell Signaling公司提供。

1.2方法

1.2.1動物實驗模型的構建 40只Wistar雄性大鼠，適應性喂養2周后，隨機分為空白組和模型組。模型組喂食高脂飼料，空白組喂食普通飼料，連續喂食6周后，將模型組隨機分為高脂飲食組(HFD)，黃連素Berberine 組(HFD+BR)，益生菌V9治療組(HFD+V9)，益生菌V9對照組(V9)4組，并且將高脂飼料換成普通飼料。根據大鼠的體重進行灌胃給藥，給藥劑量為黃連素300 mg/kg,益生菌V9 1×109CFU/ml，空白組給予對應的生理鹽水。4周后，進行心臟取血，處死大鼠并收集肝臟。

1.2.2血清中AST、ALT的檢測 離心稀釋后的血清送至內蒙古自治區人民醫院檢驗科，通過全自動生化分析儀進行檢測。

1.2.3HE染色觀察肝臟組織的病理學變化 取部分肝臟組織用10%的甲醛固定，使用酒精脫水、二甲苯進行透明，浸蠟包埋后制片，采用蘇木精-伊紅染色法，在顯微鏡下觀察肝臟組織的病理學變化。

1.2.4血清、肝組織中氧化應激相關指標的檢測 血清及肝組織中MDA、SOD、TC含量均使用南京建成生物工程試劑盒進行測定，具體檢測方法參考試劑盒說明書。

1.2.5Western blot實驗檢測SOD2和PPAR-γ蛋白的表達含量 大鼠肝組織破碎勻漿，4℃，12 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白濃度。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，加樣后，濃縮膠80 V，分離膠120 V，120 min，電泳。利用濕法進行轉膜，條件為2 h，110 V。將PVDF膜放于5%的脫脂奶粉中封閉4 h。孵育一抗，TBST洗滌后，孵育二抗，再次清洗后，利用底物顯色法檢測相關蛋白的表達情況。

1.2.6Real-time PCR檢測基因PPAR-α的mRNA表達水平 Trizol法提取大鼠肝組織的總RNA，測定RNA濃度，要求OD260/280的值在1.8～2.0之間并將抽提到的RNA進行反轉錄。反應條件：95℃ 10 min,95℃ 15 s,60℃ 1 min,共40個循環。按照公式2-ΔΔct進行計算，引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of Real-time PCR

2 結果

2.1益生菌V9對血清中ALT、AST水平的影響 機體的肝功能檢測指標主要指AST和ALT，當肝功能受到損傷時，兩種轉氨酶水平會升高。通過全自動生化分析儀檢測ALT、AST水平，檢測結果如圖1所示，與Control組相比，HFD組的ALT、AST水平顯著升高(P<0.05)，而V9對照組差異無統計學意義，證明益生菌V9是安全可用的；與HFD組相比，HFD+V9和Berberine組的ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)。說明益生菌V9可以改善HFD誘導的肝損傷。

圖1 益生菌V9對血清中ALT、AST水平的影響Fig.1 Effects of Probiotic V9 on serum levels of ALT and ASTNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.2益生菌V9對病理學組織的影響 通過HE染色，觀察大鼠肝臟組織的情況，結果如圖2所示，Control組的肝細胞正常，細胞核并沒有損傷情況(圖2A)；與Control組相比，HFD組的肝細胞發生腫脹、壞死，細胞核破裂，炎癥細胞浸潤以及存在壞死灶現象(圖2B);HFD+V9和Berberine組的肝細胞損傷情況以及炎癥反應與HFD組相比明顯減輕(圖2C、D)；V9組的肝組織情況與Control組相似(圖2E)。說明益生菌V9能夠改善高脂飲食誘導的肝損傷情況并對肝組織有一定保護作用。

圖2 益生菌V9作用后對高脂飲食誘導的肝損傷組織學的緩解Fig.2 Histological mitigation effect of V9 on HFD induced liver injuryNote:A.Control group;B.HFD group;C.Berberine group;D.HFD+V9 group;E.V9 group.

2.3益生菌V9對血清和肝臟組織中MDA水平的影響 丙二醛MDA是一種脂質過氧化物，其濃度的大小通常可以反映機體內脂質過氧化程度的高低。使用試劑盒測定MDA的水平，測定結果如圖3所示，在血清和肝臟組織中，V9對照組的MDA水平接近于Control組，但HFD組的MDA水平顯著高于Control組(P<0.05)，說明HFD組的過氧化程度較高；HFD+V9組和Berberine的MDA水平顯著低于HFD組(P<0.05)，證明益生菌V9可以抑制MDA水平的升高，緩解機體內的脂質過氧化反應。

圖3 益生菌V9對血清和肝臟組織中MDA水平的影響Fig.3 Effects of Probiotic V9 on levels of MDA in serum and liverNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.4益生菌V9對于血清和肝臟組織中SOD、SOD2表達的影響 超氧化物歧化酶SOD和SOD2能夠清除機體內的超氧化物自由基的毒害能力，維持機體氧化與抗氧化的平衡，因此測定SOD、SOD2的表達情況可以觀察益生菌V9是否具有抗氧化的能力。使用試劑盒測定SOD的活力，結果如圖4所示，在大鼠的血清和肝臟中，HFD組的SOD活力與Control組相比，顯著降低(P<0.05)，V9對照組表達正常；Berberine和HFD+V9組的SOD活力與HFD組相比，顯著升高(P<0.05)(圖4A、B)。通過Western blot分析肝臟中SOD2的表達情況，與Control組相比，HFD組的SOD2表達顯著降低(P<0.05)，可能實驗動物對于益生菌V9產生應激反應，導致V9對照組的SOD2表達高于Control組；Berberine與益生菌V9治療后，SOD2的表達量顯著增高(P<0.05)(圖4C、D)，說明益生菌V9具有一定的抗氧化能力。

圖4 益生菌V9對血清和肝臟組織中SOD以及SOD2的影響Fig.4 Effects of Probiotic V9 on activity of SOD，SOD2 in serum and liverNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

2.5益生菌V9對于糖脂代謝的影響 總膽固醇TC是指血液中所有脂蛋白所含膽固醇的總和，其濃度可以作為檢測糖脂代謝的指標，若TC值偏高則說明人體的肝臟組織開始發生病變。使用試劑盒測定TC的含量，結果如圖5所示，與Control組相比，V9對照組表達正常，HFD組的血清和肝臟組織中TC含量顯著升高(P<0.05)；與HFD組相比，Berberine和HFD+V9組的TC含量顯著下降(P<0.05)(圖5A、B)，證明益生菌V9可以緩解肝臟組織中的病變情況。

圖5 益生菌V9對于糖脂代謝的影響Fig.5 Effects of probiotic V9 on glucolipid metabolismNote:#.P<0.05 vs Control；*.P<0.05 vs HFD.

過氧化物酶增殖激活受體PPAR-α和PPAR-γ是核受體超家族成員,二者參與肝脂肪代謝和脂肪細胞的分化。利用Real-time PCR法檢測PPAR-α的mRNA水平，結果如圖5C所示，V9對照組表達正常，HFD組PPAR-α的mRNA水平顯著低于Control組(P<0.05)；Berberine和HFD+V9組PPAR-α表達量與HFD組相比顯著升高(P<0.05)。通過Western blot分析可知，與Control組相比，HFD組的PPAR-γ表達顯著降低(P<0.05)，Berberine和益生菌V9治療后，PPAR-γ表達情況顯著升高(P<0.05)(圖5D、E)，證明益生菌V9促進了PPAR-α和PPAR-γ的表達。

3 討論

NAFLD是一種常見的慢性肝病，因其廣泛性、高發性已經成為我國的第二大慢性肝病[10]。對于這種發病機理復雜且與各種因素有關的疾病，仍然沒有較為準確的理論解釋它的發生[11]。本實驗以第二次打擊“炎癥反應和氧化應激反應”[12]為理論依據，建立NAFLD的模型，研究益生菌雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠肝功能、氧化應激以及脂代謝的影響。為了觀察NAFLD大鼠的肝細胞是否發生損傷以及損傷程度，即測定了血清中ALT和AST的水平，發現HFD組的ALT、AST水平顯著高于Control組，說明HFD組的肝功能受損，但是益生菌V9和Berberine治療后，緩解了NAFLD大鼠的肝功能受損情況。

益生菌是一種通過調節宿主微生態系統平衡對宿主產生有益影響的活性微生物[13]。已有研究學者發現益生菌可以作為一種新的治療策略治療NAFLD[14,15]：如益生菌合劑憑借其對脂質、瘦素以及炎癥標志物的作用，治療NAFLD;口服復方益生菌可以緩解NAFLD患者的腸道微生物失調和代謝紊亂現象。本實驗則探究益生菌V9是否可以通過抗氧化途徑改善NAFLD的肝損傷情況。通過檢測血清和肝臟組織中的MDA水平，發現益生菌V9可以抑制MDA水平的升高，從而緩解機體內的脂質過氧化反應。并且益生菌V9提高了機體內SOD和SOD2的表達，證明了它具有一定的抗氧化能力。

NAFLD的發生與糖脂代謝異常緊密相關，脂代謝紊亂導致了肝細胞發生脂肪變性和脂肪沉積[16]。通過檢測血清和肝臟組織中的TC含量，發現HFD組的TC值偏高，證明肝臟組織有代謝紊亂的癥狀存在。PPAR-α作為調節脂質代謝的關鍵因子,在代謝活性較高的組織中如肝臟、肌肉、脂肪組織等高表達[17]。通過Real-time PCR法檢測PPAR-α的mRNA水平，同時利用Western blot 分析PPAR-γ的表達情況，發現HFD組的PPAR-α和PPAR-γ表達受到抑制，肝脂肪代謝和脂肪細胞的分化能力下降，導致脂質在肝臟中發生沉積。但是益生菌V9的加入可以抑制TC含量的上升并且增強PPAR-α和PPAR-γ的表達，從而調節NAFLD的脂代謝紊亂，減輕肝細胞脂肪變性和脂質沉積的現象。

現有研究發現GRK2參與小鼠和人類非酒精性脂肪變性和脂肪性肝炎的發生[18]，抑制PDLIM2 NF-κB的活化可以阻抑高脂飲食誘導的小鼠肝脂肪生成和炎癥的發生[19]，異生核受體的調節與NAFLD的產生有關[20]。關于NAFLD的診斷和治療，因缺乏準確的發病機制而受到限制，所以需要更多新的治療技術和藥物。本實驗中，益生菌V9可以作為一種更安全更新型的治療手段，但仍需要更加深入地研究其作用機制，以便更好地開發利益生菌V9。