miR-137對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應及自噬的作用及機制研究①

丁 童 贠 霄 周彥鵬 楊衛強 馮立平

(新鄉市中心醫院創傷外科，新鄉 453000)

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種關節軟骨和骨連接處損傷的關節疾病,最主要的癥狀為關節疼痛和僵硬，并伴有關節腫痛，活動受限，四肢麻木等[1]。骨關節炎為最常見的關節疾病，影響著大約2.37億人(約占總人口的3.3%)[2]。在超過60歲的老年人口中，大約有10%的男性和18%的女性受到關節炎的折磨[1]。既往研究報道，miR-137在多種腫瘤中表達下降，并且可以作為腫瘤預后的診斷分子，如肺癌、結腸癌、口腔鱗狀細胞癌等[3,4]。另一方面，miR-137還可以通過靶向MK2基因來抑制炎癥應答和細胞凋亡來保護脊柱神經損傷[5]。另外還有研究證明，在人類及小鼠的生長發育過程中，miR-137具有促進神經干細胞分化的作用[6]，同時IL-1β還在OA的發生發展中具有重要作用，如IL-1β可以促進滑膜細胞和關節軟骨細胞釋放中性蛋白酶和前列腺素E2，這些因子通過刺激關節細胞發生關節炎癥，而導致關節發生退行性關節炎[7]。但是針對OA發生發展涉及miR-137和IL-1β相關的信號機制研究結果鮮有報道，因此我們根據既往的研究結果，利用IL-1β誘導的大鼠軟骨細胞炎癥反應為研究體系，對軟骨細胞中可能對細胞命運產生影響的miR-137機制進行深入探究，期望為軟骨細胞炎癥的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM細胞培養液、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司。轉染試劑盒Lipofecta-mine3000(貨號：L3000008)購自Thermo公司。IL-1β(貨號：ab119727)、BMP2(貨號：ab14933)、CollagenⅠ(貨號：ab34710)、Beclin-1(貨號：ab207612)、P62(貨號：ab56416)、LC3A/B(貨號：ab128025)、β-actin(貨號：ab124964)一抗購自美國abcam公司。HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。SYBR PCR Master Mix(貨號：4309155)購自賽默飛公司。IL-6(貨號：E-EL-M0044c)、iNOS(貨號：E-EL-R0520c)、TNF-α(貨號：E-EL-R0019c) BGP(貨號：E-EL-R0243c)、ALP(貨號：E-BC-K091)ELISA試劑盒購自Elabscience公司。3月齡SD雌性大鼠，體重(260±20)g，購自北京維通利華。所有實驗操作均遵從于《實驗動物管理條例》。

1.2方法

1.2.1大鼠原代軟骨細胞分離 將3月齡SD雌性大鼠，膝關節軟骨于無菌環境下取出，放進無菌操作臺，使用PBS沖洗3次，剔除非軟骨組織。用PBS再次清洗后放入離心管中，加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培養箱30 min后取出終止消化，去除成纖維細胞；將樣品轉入加有PBS的培養皿中，使用無菌剪將軟骨剪成1 mm3的碎塊，經PBS洗滌3次后加入膠原酶Ⅱ在37℃搖床中消化至懸液渾濁。樣品再經100 μm細胞篩過濾，收集濾液，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清，PBS清洗3次，1 000 r/min離心5 min收集細胞，按照1×107個/皿接種至10 cm 培養皿中，37℃正常培養。

1.2.2軟骨細胞轉染 軟骨細胞鋪板24 h后換液，使用Lipofectamine 3000(μl)∶待轉DNA(μg)=4∶1。按照分組進行相應轉染處理(細胞隨機分為5組,即Ctrl組，scramble組，IL-1β組，mimic組和mimic+IL-1β組。其中空白對照組正常細胞培養;scramble組細胞轉染scrambleRNA； IL-1β組細胞用10 μmol/L IL-1β處理；mimic組細胞轉染miR-137mimic；mimic+IL-1β組細胞轉染和miR-137mimic 并接受IL-1β處理)。轉染48 h后收集細胞待用。顯微鏡下(隨機挑選5個視野進行統計)得瞬時細胞轉染率約為70%。

1.2.3qRT-PCR檢測軟骨細胞中相關RNA水平 取轉染后的軟骨細胞，待細胞處于對數生長期時，用TRIzol試劑提取各組細胞總RNA，測定RNA濃度、純度后，用反轉錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進行擴增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對miR-137表達水平進行檢測，以GAPDH為內參。實驗所用引物均采用Primer 3 Plus網站設計，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，重復3次。

1.2.4Western blot檢測細胞中蛋白表達 收集細胞，PBS清洗3次，用添加有終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的細胞裂解液進行裂解，提取各組細胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進行)，10%SDS-PAGE膠分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4℃封閉過夜，第二天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。顯色并統計灰度值計算相對表達量。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子 胰酶消化細胞收集后，低溫離心機800 r/min離心8 min，將收集細胞進行冷PBS洗滌3次；將細胞處于-20℃與室溫之間進行反復凍融3次后于1 500 g離心10 min收集上清液供實驗使用。加樣設置：分別設空白孔，標準品孔，待測樣品孔。酶標包被的板子上加標準品50 μl，先加入樣品稀釋液40 μl于待測樣品孔，然后加待測樣品10 μl。孵育：封板后置于37℃環境進行30 min孵育。液體配置：把30×洗滌母液經蒸餾水稀釋30倍備用。洗滌：緩慢揭掉封板膜，將液體棄去，甩干液體，每孔加洗滌液，放置30 s之后棄去，重復5次，拍干板子。加酶：每孔加酶標試劑50 μl，空白孔不加。孵育：再次封板后放37℃孵育30 min。洗滌：小心取掉封板膜，甩去液體，甩干液體，每孔加適量洗滌液，放置30 s之后棄去，重復5次，拍干板子。顯色：各孔加入顯色劑A液50 μl，再加顯色劑B液50 μl緩慢振蕩混勻后，37℃避光進行顯色10 min。終止：各孔加入50 μl終止反應液，反應終止(終止后藍色立即轉為黃色)。測定：用空白孔進行調零，450 nm波長下依次測量每孔吸光值(OD值)。測定應在加入終止液后的15 min內進行。

1.2.6免疫熒光 操作步驟按照說明書進行，細胞接種于預先用0.01%多聚賴氨酸包被的蓋玻片，經藥物處理后，加入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封閉液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入預溫的封閉液，室溫下封閉1 h；孵育一抗4℃過夜。次日，PBS漂洗，孵育熒光標記的二抗(濃度為1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果

2.1miR-137在不同處理組中差異表達 經過細胞瞬時轉染及添加IL-1β后miR-137表達水平：與空白Ctrl組比較，陰性對照scramble組miR-137表達水平無顯著差異(因此后續實驗不再添加Ctrl組比較)；與scramble組比較，單獨添加IL-1β組miR-137表達水平顯著下調(P<0.01，圖1)；而miR-137 mimic組中miR-137表達水平則明顯上升。

圖1 miR-137在不同處理組中表達差異Fig.1 Expression of miR-137 was detected in chondro-cytes among different groupsNote:The expression of miR-137 was detected by qRT-PCR.Data shown are the means of each group.**.P<0.01 compared with the scramble group.Bars,SEs.

2.2miR-137對BGP和ALP表達的影響 細胞經過瞬時轉染各組外源核酸及IL-1β后，經過ELISA檢測BGP和ALP表達水平發現：miR-137 mimic組與scramble組之間BGP和ALP表達水平沒有顯著差異；但是經過IL-1β處理后，BGP和ALP表達受到顯著的下調(P<0.01，圖2)；與IL-1β組比較，mimic+IL-1β組BGP和ALP表達水平得到一定的補償，差異具有統計學意義(P<0.01，圖2)。

圖2 ELISA檢測軟骨細胞中BGP和ALP表水平Fig.2 Expression of BGP and ALP were detected by ELISANote:Data are expressed as compared with the mimic group;##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.3miR-137 促進軟骨細胞中軟骨功能相關蛋白表達 經過Western blot檢測各組處理后的組織細胞發現：mimic組軟骨細胞中BMP2和CollagenⅠ表達量與scramble組之間無顯著差異；但是經過IL-1β處理后，BMP2和CollagenⅠ表達水平顯著下調(P<0.01，圖3)；而mimic+IL-1β組軟骨細胞中BMP2和CollagenⅠ表達量則有所恢復，相對于IL-1β組差異具有顯著的統計學意義(P<0.01，圖3)。

圖3 Western blot檢測各處理組軟骨細胞中BMP2和CollagenⅠ表達水平Fig.3 BMP2 and CollagenⅠ were detected by Western blot in each group of chondrocytesNote:BMP2 and CollagenⅠ were detected using Western blot analysis.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.4miR-137抑制軟骨組織細胞中炎癥因子表達 各組細胞經過相應處理后利用ELISA檢測相關炎癥因子發現：與scramble組相比，mimic組軟骨細胞內炎癥因子IL-6、iNOS和TNF-α水平無顯著差異；與mimic組相比，IL-1β處理后的軟骨細胞中相關炎癥因子表達水平發生明顯的上調(P<0.01，圖4)；mimic+IL-1β組軟骨細胞中相關炎癥因子表達水平受到顯著抑制(P<0.01，圖4)。

圖4 ELISA檢測各處理組中軟骨細胞炎癥因子表達水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in each group of chondrocytesNote:IL-6,iNOS and TNF-α were detected using ELISA.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.5miR-137抑制軟骨細胞中自噬相關蛋白質的表達 Western blot檢測各組軟骨細胞中自噬相關蛋白質分子發現：與scramble組細胞相比，mimic組細胞中自噬相關的Beclin-1、P62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平沒有顯著性差異；與mimic組細胞表達水平相比，IL-1β組細胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平發生顯著上調，而P62表達水平發生明顯下調(P<0.01，圖5)；與IL-1β組相比，mimic+IL-1β組中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平受到了明顯的下調，而P62的表達水平則顯著上調(P<0.01，圖5)。免疫熒光染色鑒定細胞內LC3+細胞顯示：與scramble組比較，mimic組LC3+細胞含量和數量之間沒有顯著性差異；與mimic組相比，IL-1β組LC3+細胞中發現大量的綠色熒光，并且幾乎所有的細胞中都有分布；與IL-1β組相比，mimic+IL-1β組中LC3陽性的數量相對減少，熒光亮度減弱，并且差異具有統計學意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Western blot和免疫熒光技術檢測各處理細胞自噬相關分子表達和分布情況Fig.5 Expression and distribution of autophagy-related proteins were detected by Western blot and immunofluorence in each group of chondrocytesNote:The autophagy markers were detected by Western blot.The LC3+were detected by the immunofluorence.Data are expressed as the compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

3 討論

OA是被公認的最常見的致殘影響因素之一，會伴隨著長期慢性疼痛并降低運動耐受能力[8,9]。OA形成的諸多風險因素主要包括：體重，年齡，女性，關節受損、過度使用，肌肉和韌帶無力等[10]。關節軟骨內唯一具有功能的軟骨細胞數目及穩定的功能對維持軟骨基質合成、軟骨穩態和降解平衡有著至關重要的作用。OA發生的同時，炎癥因子、異常力學刺激等都會使軟骨局部微環境發生變化，導致軟骨細胞功能異常、肥大、數目減少，軟骨基質合成能力減弱，聚蛋白多糖分泌減少，基質降解酶(金屬基質降解酶：Matrix Metalloproteinases，MMPs)等表達增加，促使軟骨基質降解[11]。

miR-137雖然在多種腫瘤中表達下降，可以作為腫瘤治療預后的診斷分子[3,4]，同時miR-137還可以通過靶向MK2基因來抑制炎癥應答和細胞凋亡來保護脊柱神經損傷[5]。說明miR-137具有一定的炎癥抑制作用。有研究報道，IRF1和NF-κB依賴的iNOS激活可以產生炎癥反應，從而產生大量的炎癥因子，如促炎因子IL-1、TNF-α和干擾素γ等[12]。一般機體誘導產生大量的iNOS通常是在氧化環境中，高表達水平的NO通常會與超氧化物發生反應，導致過氧化亞硝基產物產生細胞毒性[13]。本研究發現，經過IL-1β處理后的軟骨細胞表達大量炎癥因子IL-6、iNOS和TNF-α；但是經過miR-137 mimic處理后得到了明顯改善，證明miR-137可以有效抑制軟骨細胞炎癥的分泌。

細胞自噬對于軟骨細胞具有兩面性作用：既可以作為細胞中細胞器組建的原材料供應者，也就是細胞結構經過自噬后再循環利用，來保證細胞常態下代謝活動的高效利用；又可以因為外部環境不適，造成細胞自噬依賴的程序性死亡異常啟動，造成這一現象差異的原因可能是因為疾病不同進展階段造成的影響，或是生理病理狀態導致的差異而形成不同的自噬作用[14]。另據文獻報道，miR-137可以通過靶向ATG7的表達來抑制饑餓誘導的自噬現象[15]。我們研究發現在scramble組正常表達的基礎上，IL-1β組軟骨細胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ發生明顯的上調，P62發生下調；說明軟骨細胞內發生了自噬作用來響應IL-1β的刺激，并有進一步發生自噬性凋亡的趨勢；但是在miR-137+IL-1β組中，自噬相關蛋白表達水平又有一定的下調趨勢，說明miR-137可以有效抑制軟骨細胞中自噬進展，保護細胞免受凋亡的影響。

當然，軟骨細胞炎癥的發生發展具有十分復雜的特點，而且據報道自噬在其中發揮調節的方式也不盡相同[14]。根據研究結果顯示，IL-1β誘導產生的軟骨細胞炎癥發生了強烈的自噬現象，說明細胞命運更加趨向于自噬依賴性的程序性死亡。細胞代償性增加自噬作用有利于細胞生存，但是若持續性增加自噬作用細胞便會受到損害而發生凋亡[14-20]。因此針對該項實驗方案還需要進一步探究相關凋亡通路活性來驗證自噬和凋亡之間的相互作用關系；并進一步深入探究IL-1β在該軟骨細胞炎癥誘導模型中的信號機制。

綜上，miR-137可以在IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應體系中有效降低細胞炎癥反應和細胞自噬水平，并可以刺激細胞分泌大量的BMP2和CollagenⅠ，來發揮軟骨細胞生理活性功能。miR-137這種對軟骨細胞炎癥的保護效果為骨關節炎癥的治療提供了一種全新的參考形式。但是涉及microRNAs的調控通路眾多而復雜，明確具體信號調控機制才能為臨床精準化治療骨關節炎提供指導依據。