肝癌細胞異位過表達IL-12的抗腫瘤作用研究①

穆永亮 趙華俊 張 建 韓秋菊

(山東大學藥學院免疫藥物學研究所，濟南 250012)

腫瘤微環境是癌細胞賴以生存和維持惡性增殖的內環境，呈現明顯的免疫抑制狀態[1]。利用細胞因子增強機體免疫應答、破壞腫瘤細胞的免疫逃逸狀態，成為腫瘤生物治療的重要策略之一。其中，IL-12尤為引人關注，被認為具有應用于臨床治療腫瘤的潛力[2,3]。

IL-12是由 p35、p40 兩個亞基共同組成的異源二聚體，主要由樹突狀細胞、巨噬細胞分泌，能夠誘導T細胞、NK細胞的激活，在臨床上已被用于黑色素瘤、腎細胞腺癌等多種疾病的輔助治療[4]。然而，在臨床應用過程中，人們逐漸關注到全身使用IL-12治療可引起明顯的毒副作用，并且IL-12半衰期較短，停藥后療效迅速消失[5,6]。

多年來，研究者致力于改造IL-12或者通過改變給藥途徑/部位以降低毒副作用。有科學家通過刪除IL-12單鏈的N末端對其結構進行改造，利用靶向腫瘤的溶瘤腺病毒作為載體，在胰腺癌治療中取得了良好的效果，且沒有顯著的毒副作用[7]。也有研究發現，瘤內注射表達IL-12的質粒(pIL-12)能夠控制IL-12的局部表達，并激活腫瘤微環境中免疫應答，進而發揮抗腫瘤作用，并且降低了IL-12的副作用。2017年FDA批準pIL-12為治療不可切除轉移性黑色素瘤的罕見藥[8]。

本研究中，我們首先將mIL-12-PsecTag過表達質粒轉染入小鼠來源的肝癌細胞系Hepa1-6中，觀察肝癌細胞生物學特性的變化，進一步利用小鼠體內實驗探索過表達IL-12的抗腫瘤作用和免疫激活作用，為進一步探討IL-12基因治療肝癌提供必要的實驗數據。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。鼠肝癌細胞系Hepa1-6購于中國科學院上海細胞庫。DMEM培養基購自Hyclone公司；胰酶購自Sagon上海股份有限公司；新生胎牛血清購自天津瀞洋科技有限公司；mIL-12-PsecTag過表達質粒由本實驗室構建；mIL-12 ELISA 試劑盒購自聯科生物技術公司；LipoTM2000脂質體購自Invitrogen；Trizol購自Invitrogen公司；Sybr Green Mix購于Roche生物有限公司；CCK-8和總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司；引物由上海派森諾生物科技股份有限公司；anti-CD3、anti-NK1.1、anti-CD8、anti-IFN-γ、anti-TNF-α、anti-PD-L1、anti-CD69等抗體購自eBioscience 公司；pSTAT1、STAT1抗體及HRP羊抗兔二抗均購自CST公司。

1.2方法

1.2.1質粒轉染 取對數生長期細胞接種于6孔板中(1×106個)，培養過夜。次日，更換無血清培養基。將2 μg質粒加至250 μl無血清培基中混勻，同時將 4 μl Lipo-2000脂質體加至另外250 μl無血清培基中，輕吹混勻，室溫靜置5 min。將DNA懸液與脂質體懸液輕輕混勻，靜置20 min，將復合物均勻加入每孔中，培養4 h后更換含10%血清的培養基。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖 接種狀態良好的細胞，調節細胞濃度至1×106個/孔(6孔板)；次日，分別轉染空載體和IL-12過表達載體；轉染 6 h 后，消化細胞重新接種到96孔板，6 000個/孔，培養不同時間后棄掉上清，加入10%CCK-8溶液100 μl，培養4 h；在450 nm處測定吸光度，并計算細胞活力。

1.2.3熒光定量PCR 參照Trizol說明書，提取細胞總RNA。將總RNA逆轉錄成cDNA并進行PCR反應。鼠IL-12上游引物為:GGTGTCTTAGCCAG-TCC，下游引物為CAGCTCCCTCTTCTTGT；IL-12Rβ2上游引物為CATGTTGCTGATGTGGGGGAAT，下游引物為ACTTATGCACTTGAGCGGGGGG。

1.2.4Transwell檢測細胞遷移和侵襲 轉染mIL-12-PsecTag過表達載體或對照空載體后，收集Hepa1-6細胞上清，將其加入Transwell下室。在觀察腫瘤細胞的遷移能力時，上室加入未經處理的Hepa1-6細胞，共培養12 h；在觀察異位過表達IL-12對淋巴細胞的募集作用實驗中，上室加入脾細胞，共培養12 h，觀察脾細胞的募集數量。

1.2.5Western blot檢測STAT1活化 按照上述方法轉染空載體和IL-12過表達載體，提取總蛋白；按照常規實驗步驟完成SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉；將pSTAT-1和STAT1抗體按照1∶1 000孵育過夜；次日洗滌3次；二抗(1∶5 000)孵育1 h；洗滌3次 后進行顯影及結果分析。

1.2.6小鼠肝臟單個核細胞分離 處死小鼠，剝離肝臟組織，離心(50 g,1 min)去除肝實質細胞，將上層液轉移至新的50 ml離心管中；兩次離心(400 g,6 min)后棄掉上清，底層細胞沉淀用40% Percoll溶液重懸，離心；加入紅細胞裂解液，4℃裂解10 min；加1×PBS離心，懸起底層細胞，于4℃放置備用。

1.2.7FACS檢測細胞中蛋白水平 每個流式管中加入20 μl大鼠血清進行封閉；加入適量不同抗體，并設置單標對照、同型對照，4℃放置1 h。離心洗滌兩次 (400 g,6 min)；棄掉上清，每管加入200 μl PBS將底層細胞懸起，于流式儀上進行檢測。對于胞內細胞因子檢測，經固定、穿膜后，標記IFN-γ、TNF-α抗體，孵育2 h后，洗滌2次，流式細胞儀進行檢測。

1.2.8荷瘤小鼠體內實驗 選取6周齡的雄性C57BL/6小鼠，每只小鼠皮下注射2×106個Hepa1-6細胞。荷瘤1周后，瘤內注射PsecTag-mIL-12載體，每3天注射1次，每次15 μg，共計4次。3周后，處死小鼠，取腫瘤組織并稱重；FACS檢測瘤內淋巴細胞活化水平。

1.3統計學處理 數據應用SPSS13.0統計軟件進行分析，兩組數據間比較采用配對t檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義，P<0.01為差異具有顯著統計學意義。

位于一六多金屬礦田南部、天門坳—牛公錐西主干斷裂中段西側、梅子沖銀鉛鋅礦床南約4km處(圖1)。赤老頂銻礦歷史悠久，于清末始被發現和開采，礦體主要呈似層狀、透鏡狀賦存于天子嶺組內的硅化層或硅化斷裂破碎帶中，主礦體賦礦標高為409～134m，目前最深開采標高至+170m左右。斷裂發育，具有近SN、NNE、NNW、NW、近EW及NE向等多組斷裂，其中近SN向、NNE向、NNW向組與礦化關系較密切。圍巖蝕變主要為硅化、方解石化。區內未見巖體出露。

2 結果

2.1mIL-12-PsecTag載體在肝癌細胞中有效表達IL-12 我們利用Lipo2000脂質體將mIL-12-PsecTag過表達載體轉入小鼠肝癌細胞系Hepa1-6細胞，進一步檢測IL-12基因和蛋白水平。如圖1A所示，與PsecTag空載體組相比，PsecTag-mIL-12組IL-12的mRNA水平顯著升高。進一步用ELISA試劑盒對細胞上清中IL-12含量進行檢測也觀察到同樣的結果(圖1B)。以上結果證實，PsecTag-mIL-12載體可以在小鼠肝癌細胞中有效表達。

圖1 mIL-12-PsecTag載體在肝癌細胞中有效表達IL-12Fig.1 Ectopic expression of IL-12 by Hepa1-6 cells transfected with mIL-12-PsecTag vectorNote:**.P<0.01.

2.2異位過表達IL-12能抑制Hepa1-6細胞增殖和遷移 為了證明異位過表達IL-12能夠通過自分泌形式影響肝癌細胞，我們首先對Hepa1-6細胞IL-12受體進行了檢測。如圖2A所示，Hepa1-6細胞表達較高水平IL-12Rβ2，且mIL-12過表達能夠顯著提高其表達水平。然后，我們觀察異位過表達IL-12對肝癌細胞惡性特征的直接影響。如圖2B結果所示，轉染PsecTag-mIL-12能夠抑制Hepa1-6細胞增殖。接下來，利用Transwell的方法檢測PsecTag-mIL-12載體對Hepa1-6細胞遷移和侵襲的影響。結果發現，與空載體組相比，過表達IL-12組Hepa1-6細胞遷移能力明顯下降，且侵襲數量顯著降低(圖2C、D)。以上結果說明，異位過表達IL-12能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

圖2 異位過表達IL-12能抑制肝癌細胞增殖、遷移及侵襲Fig.2 Ectopic expression of IL-12 could inhibit prolifera-tion,migration and invasion of Hepa1-6 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3異位過表達IL-12能抑制肝癌細胞負調分子的表達 腫瘤細胞能夠通過多種方式來逃避免疫系統的攻擊，而免疫抑制通路在腫瘤微環境中發揮了重要作用[1]。因此，我們對肝癌細胞免疫負調細胞因子TGF-β和免疫檢查點分子PD-L1的表達水平進行了檢測。如圖3A所示，與空載體組相比，Hepa1-6細胞過表達PsecTag-mIL-12后，其上清中TGF-β含量顯著降低。流式細胞術結果發現，過表達IL-12后Hepa1-6細胞表面PD-L1的表達水平明顯下調(圖3B)。以上結果提示，過表達IL-12能顯著抑制肝癌細胞免疫負調分子的表達。

圖3 異位過表達IL-12能抑制肝癌細胞負調分子的表達Fig.3 Ectopic expression of IL-12 could decrease expression of inhibitory molecules in HCCNote:*.P<0.05.

2.4肝癌細胞過表達IL-12能促進淋巴細胞的募集 我們進一步觀察Hepa1-6細胞異位過表達IL-12對脾淋巴細胞的募集作用。Transwell實驗結果顯示，與空載體組相比，過表達PsecTag-mIL-12的Hepa1-6細胞上清所募集的脾細胞數量顯著增加(圖4A、B)。這一結果提示，異位過表達IL-12在促進淋巴細胞募集的同時，有可能對淋巴細胞發揮調節作用。

圖4 肝癌細胞異位過表達IL-12能促進淋巴細胞的募集Fig.4 Ectopic expression of IL-12 in HCC could promote recruitment of lymphocytes in vitroNote:*.P<0.05.

2.5過表達IL-12能促進CD8+T細胞活化 為了進一步分析PsecTag-mIL-12載體轉染肝癌細胞對所招募的免疫細胞亞群的影響，我們利用不同處理組的Hepa1-6細胞上清孵育脾細胞，然后利用流式細胞術的方法分析不同淋巴細胞亞群活化狀態。結果顯示，與空載體組相比，IL-12過表達組肝癌細胞上清能顯著提高CD8+T細胞CD69的表達水平(圖5A)，并且CD8+T細胞中IFN-γ和TNF-α分泌亦有顯著升高(圖5B、C)。我們進一步利用Western blot方法檢測上述小鼠脾單個核細胞中STAT1的活化水平，結果發現，與空載體組相比，IL-12過表達組肝癌細胞上清處理的脾細胞中磷酸化STAT1水平顯著增加(圖5D)。以上結果表明，過表達IL-12能夠激活STAT1信號通路并誘導CD8+T細胞活化。

圖5 肝癌細胞異位過表達IL-12能激活STAT1信號通路促進CD8+T細胞活化Fig.5 Ectopic expression of IL-12 in HCC could IL-12 could activate T cells via STAT1 signalNote:*.P<0.05.

2.6IL-12載體能夠激發荷瘤小鼠體內抗腫瘤免疫應答 最后，我們建立移植腫瘤模型，通過瘤內注射IL-12載體的方式觀察抗腫瘤作用。結果顯示，與空載體組相比，PsecTag-mIL-12治療組腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長速度顯著降低(圖6A、B)。進一步分析腫瘤浸潤淋巴細胞的活化水平，如圖6C所示，PsecTag-mIL-12治療組瘤內CD8+T細胞中CD69表達水平顯著上調，且CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的量明顯增加。我們還觀察到，PsecTag-mIL-12治療后，腫瘤內NK細胞CD69表達水平也發生顯著升高(圖6D)。以上結果說明，瘤內注射IL-12表達載體能夠活化微環境中免疫細胞，從而發揮抗腫瘤作用。

圖6 瘤內注射IL-12能抑制小鼠體內腫瘤生長并有效活化免疫細胞Fig.6 Intratumoral injection of IL-12 could inhibit tumor growth and activate immune cells in mice bearing Hepa1-6 cells Note:*.P<0.05.

3 討論

改善肝癌微環境免疫抑制狀態對于提高抗腫瘤效果具有重要的作用，其中增加抗腫瘤免疫應答的細胞因子是促進抗腫瘤免疫應答的策略之一。基于IL-12在誘導抗腫瘤免疫應答中發揮非常重要的作用[2]，并考慮到系統應用IL-12的副作用，本研究中我們構建了PsecTag-mIL-12過表達載體，擬通過腫瘤細胞內過表達的途徑激活免疫系統，研究其抗肝癌的作用。我們發現，由于肝癌細胞表達IL-12受體，過表達的IL-12可以通過自分泌的形式與肝癌細胞表面受體結合，進而激活胞內信號通路，最終影響細胞增殖和遷移(圖1和圖2)。也有研究利用電轉IL-12載體的方式在乳腺癌、黑色素瘤中進行治療，同樣也觀察到顯著的抗腫瘤效果[9,10]。

TGF-β不僅能夠調節腫瘤細胞生長和分化，還能夠通過多種途徑幫助癌細胞逃避免疫系統的攻擊[11,12]。我們觀察到，肝癌細胞異位過表達IL-12能夠降低TGF-β的表達(圖3A)。此外，通過瘤內注射腺病毒IL-12載體在乳腺癌模型中也觀察到類似的現象，且TGF-α介導的Treg細胞分化亦受到顯著抑制[13]。在進一步實驗中，我們將在肝癌模型中觀察過表達IL-12對Treg細胞分化及功能的影響。

腫瘤微環境中高表達的PD-L1與腫瘤的免疫耐受密切相關，其通過與PD-1結合來抑制T細胞的功能，導致抗腫瘤免疫應答受到嚴重影響[14,15]。我們發現，異位過表達IL-12能夠下調肝癌細胞表面PD-L1的表達(圖3B)，這與在黑色素瘤、乳腺癌模型中瘤內注射IL-12載體觀察到的現象是一致的[9,10,13]。以上結果提示我們，IL-12基因治療能夠解除腫瘤微環境中癌細胞對免疫細胞的抑制作用，促進抗腫瘤免疫應答。值得注意的是，隨著PD-1、PD-L1阻斷療法的興起，PD-1/PD-L1聯合IL-12治療方案在針對乳腺癌臨床前試驗中也取得了積極的治療效果[16-18]。

此外，腫瘤細胞還能通過降低淋巴細胞浸潤能力來逃逸免疫殺傷作用[15,19]。我們觀察到，肝癌細胞異位過表達IL-12能夠促進脾淋巴細胞的募集作用。這可能與IL-12高表達調控肝癌細胞趨化因子譜有關。有報道稱乳腺癌模型中瘤內注射IL-12能夠誘導CLL2、CCL3和CCL4的表達[20]，但是在肝癌模型中發揮關鍵作用的趨化因子尚待進一步尋找。另外，肝癌細胞異位表達IL-12能夠促進免疫細胞中STAT1信號通路的活化，促進IFN-γ和TNF-α等的表達，并且在動物實驗中也觀察到類似的結果。以上結果表明，IL-12在腫瘤微環境中局部應用能夠有效增加抗腫瘤免疫應答。

以上研究提示，局部使用IL-12能夠更好地發揮抗腫瘤作用。一方面，IL-12以自分泌方式直接影響腫瘤特性；同時，IL-12在腫瘤局部有效表達，以旁分泌的形式活化微環境中免疫細胞，改善腫瘤免疫微環境。這些實驗數據為IL-12基因治療研究奠定了重要基礎。隨著免疫學、分子生物學等技術的不斷發展，IL-12基因治療或與其他治療方法的聯合應用將為臨床腫瘤治療提供新的途徑。