miR-595在上皮性卵巢癌組織中的表達及其預后評估的價值①

蘇紅娥 鐘慶吉 符春麗 薛萬興 林 元

(海南西部中心醫院婦產科，那大 571799)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢惡性腫瘤的主要病理類型，其發病隱匿，病情進展迅速，病死率較高，對女性的生命健康造成極大的危害[1]。目前，仍沒有理想的生物學指標可以用于EOC的早期診斷、指導治療及預后評估。近期的研究發現，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在細胞分化、增殖、控制細胞周期、凋亡和新陳代謝等過程中的基因調控中起到重要作用，其中miR-595在多種惡性腫瘤中異常表達，并能通過調控多種信號通路參與惡性腫瘤的發生、發展[2,3]。本研究通過檢測EOC組織及癌旁正常組織中miR-595表達水平，分析其表達與EOC患者術后復發和生存的關系，旨在為評估EOC預后及靶向治療提供依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2013年1月至2015年12月海南西部中心醫院婦產科收治行手術治療的EOC患者150例，年齡30～76歲，平均(54.30±10.72)歲。納入標準：①符合國際婦產科聯合會(FIGO)分類標準和WHO分級標準，且經病理確診為EOC并適合手術治療者；②能配合本次研究及病歷資料完整者。排除標準：①隨訪過程中失訪，病歷資料不完整者；②術前已行放療、化療或激素治療者；③術前有急慢性感染性疾病、血液系統疾病、自身免疫性疾病及其他惡性腫瘤。本研究獲得醫院倫理委員會批準，并與患者或家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1研究方法 采用前瞻性研究方法對150例患者進行隨訪，隨訪起始時間為患者自術后第1天的時間，通過電話或門診等方式對患者進行調查，截止時間為2018年12月31日?？偵鏁r間(Overall survival,OS)定義為術后第1天至患者死亡的時間。無進展生存時間(Progression-free survival,PFS)定義為術后第1天起，未發生復發、原發器官腫瘤轉移及其他原因引起死亡的時間。納入本研究的變量包括患者年齡、絕經情況、臨床分期、病理類型、病理分級、深肌層浸潤、淋巴轉移、復發及生存時間等。

1.2.2標本采集及RNA提取 癌組織取肉眼所見的明顯腫瘤組織，癌旁正常組織取距離腫瘤邊緣3 cm 的良性卵巢組織，所取組織標本離體后置于液氮罐內迅速冷凍后置-80℃保存。取標本約100 mg，采用液氮研磨法將組織磨成粉末，然后加入約1 ml的Trizol裂解組織試劑，按Trizol試劑說明書提取總RNA。

1.2.3miR-595逆轉錄及實時熒光定量PCR 應用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒逆轉錄已定量的RNA，選用U6作為內參，反應體系為15 μl：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環引物，0.15 μl 100 mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μl逆轉錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無菌三蒸水。反應參數為：16℃反應30 min，42℃反應30 min，85℃反應5 min，4℃恒溫放置保存，每個反應均為1個循環。在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain react，RT-PCR)。反應體系為20 μl：1 μl 引物及探針Mix(20×)，10 μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μl 反轉錄產物cDNA，7.67 μl 無核酸酶的水。擴增條件為：95℃預變性10 min 1個循環，95℃變性15 s、60℃復性60 s進行45個循環，實驗重復3次。采用2-ΔΔCt法計算miR-595的相對表達水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6，其中ΔCt為Ct靶基因與Ct內參基因(U6)的差值，2-ΔΔCt表示實驗組與對照組基因表達的差異倍數。

2 結果

2.1EOC組織和癌旁正常組織miR-595表達水平比較 EOC組織miR-595表達水平(2.80±0.74)明顯低于癌旁正常組織(6.93±1.58)，差異有統計學意義(t=13.835，P<0.01)。見圖1。

圖1 EOC組織和癌旁正常組織miR-595表達水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of miRNA-595 between EOC and normal tissues adjacent to

2.2確定miR-595的最佳界值 根據miR-595繪制EOC患者術后復發和生存的ROC曲線，當miR-595取2.68時，約登指數最大。以2.68為miR-595的最佳截點，其評估EOC患者術后復發和生存的敏感度為81.6%，特異度為75.2%，曲線下面積(Area under curve，AUC)為0.814。見圖2。

圖2 miR-595繪制EOC患者術后復發和生存的ROC曲線Fig.2 miR-595 plots ROC curves of recurrence and survival in EOC patients

2.3高miR-595組與低miR-595組EOC患者的臨床病理特征比較 以miR-595=2.68為界值，將150例EOC患者分為高miR-595組(miR-595≥2.68，n=68)，低miR-595組(miR-595<2.68，n=82)。高miR-595組與低miR-595組的FIGO分期、病理分級、深肌層浸潤及淋巴結轉移比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而兩組的年齡、絕經、組織學類型及腫瘤直徑比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 高miR-595組與低miR-595組EOC患者的臨床病理特征比較Tab.1 Comparison of clinicopathological features of EOC patients between high miR-595 group and low miR-595 group

2.4miR-595表達與EOC患者術后生存和復發的關系 150例EOC患者隨訪時間10～68個月，中位隨訪時間27.5個月。生存分析顯示，低miR-595組患者總生存率明顯低于高miR-595組差異有統計學意義(46.5% vs 66.3%；Log-rankχ2=7.914，P<0.01)，見圖3；低miR-595組患者無進展生存率明顯低于高miR-595組，差異有統計學意義 (24.2% vs 53.6%；Log-rankχ2=10.627，P<0.01)，見圖4。

圖3 高miR-595組與低miR-595組EOC患者總生存時間曲線比較Fig.3 Total survival time curves of EOC patients in high and low miR-595 groups

圖4 高miR-595組與低miR-595組EOC患者無進展生存時間曲線比較Fig.4 Comparison of progression-free survival curves between high-miR-595 group and low-miR-595 group of EOC patients

對單因素分析中有統計學意義的因素調入COX回歸分析模型，結果顯示FIGO分期、淋巴結轉移及miR-595<2.68是影響EOC患者術后生存和復發的獨立危險因素[HR(95%CI)=2.726(2.105～3.824)、3.115(2.583～4.318)、3.748(3.204～6.725)]。見表2。

表2 影響EOC患者術后生存和復發的單因素及多因素COX回歸分析Tab.2 Univariate and multivariate COX regression analysis on survival and recurrence of EOC patients

3 討論

EOC的發生、發展是一個多基因改變的過程，多種癌基因和抑癌基因的表達失?；蚴Ш?，導致細胞無控增殖在腫瘤發生、發展和轉歸上起關鍵作用。miRNA是一類長度為21～25 nt的內源性單鏈非編碼RNA小分子，可激活多種胞內信號通路，參與調控細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移和分化等過程，對惡性腫瘤的發生發展產生影響，有望成為治療腫瘤患者的重要靶點[4，5]。有研究表明，miRNA在EOC中異常表達，與EOC的發生、發展、轉移及預后密切相關，可作為EOC早期診斷和預后判斷的新型標志物[6]。近年來研究發現，miR-595可以通過多種信號通路在細胞周期、超甲基化、血管生成等方面促進或抑制惡性腫瘤的發生、浸潤、轉移和耐藥等多個階段，有可能為惡性腫瘤的診斷、治療和預后判斷提供了新的靶點和思路[7，8]。Hao等[9]研究顯示，高表達miR-595導致SOX7下調，從而抑制了鼻咽癌的發生發展，提示miR-595可能在癌癥中發揮了腫瘤抑制基因作用。這些結果強調了miR-595在EOC進展中的作用，然而，miR-595能否作為一種有前景的EOC預后的生物標志物仍然存在未知。

本研究結果顯示，EOC組織與癌旁正常組織相比，EOC組織中的miR-595表達顯著降低(P<0.05)，提示miR-595可能是一種抑癌基因，其表達下降可能參與EOC的發生發展。本研究也發現miR-595隨著EOC臨床分期及組織分化的進展，miR-595表達水平呈明顯降低。而且miR-595表達水平還與淋巴結轉移密切相關，有淋巴結轉移的患者miR-595表達水平明顯低于無淋巴結轉移，表明miR-595與EOC較差的臨床病理特征有關。分析其原因可能是臨床病理特征較差的患者病情進展較快，腫瘤組織可抑制更多的具有抑癌基因作用的miR-595進入血液，同時可促進機體具有癌基因作用的miRNA水平表達，進而導致機體miR-595表達水平異常降低。Azizmohammadi等[10]研究發現，miRNA表達在EOC組織中較癌旁正常組織降低，且miRNA低表達與高組織學分級、淋巴結轉移及高FIGO分期有關，是EOC患者總生存率的獨立預測因子。另有研究表明，miRNA在EOC組織中呈低表達，且與腫瘤發生、進展密切相關，是預測EOC復發的一個很有前景的指標[11]。本研究進一步探討miR-595與EOC患者預后的臨床價值，并分析miR-595表達與生存時間之間的關系，結果顯示低miR-595組患者總生存率明顯低于高miR-595組，低miR-595組患者無病生存率明顯低于高miR-595組，說明miR-595低表達與EOC患者生存期短有關。此外，多因素COX回歸模型分析顯示，高FIGO分期、淋巴結轉移及miR-595<2.68是影響EOC患者術后生存和復發的獨立危險因素。Zhou等[12]研究顯示，miR-595低表達是EOC患者總生存率的獨立預測因子，提示miR-595可能是一種潛在的預測EOC預后的生物標志物。Wan等[13]研究發現，miRNA低表達對EOC患者總生存率及無進展生存率有顯著影響(P<0.05)，miRNA可以作為一種評估EOC患者預后的有效指標。Pan等[14]研究表明，miRNA通過影響細胞增殖和凋亡參與EOC的發生發展，而且與EOC患者的總生存率相關。亦有研究認為，在EOC中，miRNA高表抑制了細胞增殖和細胞周期的進展，miRNA低表達與FIGO分期、淋巴結轉移和總生存率較低有關，是影響EOC患者預后的獨立危險因素[15]。

綜上所述，FIGO分期、淋巴結轉移及miR-595<2.68是影響EOC患者術后生存和復發的獨立危險因素，miR-595<2.68對EOC患者術后的預后評估具有一定的價值，有望作為預測EOC預后的新型標志物，同時也能更好地指導臨床治療。但本研究為單中心研究，且miR-595的臨界值尚無明確的范圍，未來仍需大樣本、多中心試驗來進一步證實miR-595對EOC預后評估的臨床價值。