輔助性T細胞相關細胞因子在常見結腸病患者外周血中的表達水平的研究①

范英子 王 丹 周 琴 楊向貴 白婷婷 許 穎

(成都醫學院第一附屬醫院檢驗科，成都 610500)

炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一組病因和發病機制尚未明確，反復發作累及胃腸道的非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病。其中潰瘍性結腸炎是結腸黏膜層和黏膜下層連續性炎癥，常累及部位為末端回腸、結腸和肛周。受遺傳、環境和微生物因素相互影響，關鍵因素為免疫功能紊亂[1，2]。結腸息肉(Colonic polyps)也為常見結腸病變之一,根據病理組織學可分為炎性息肉、腺瘤性息肉和增生性息肉，其中腺瘤性息肉與結腸癌的發生發展有著密切的關系，目前常用的檢測手段和治療方法為電子腸鏡[3，4]，腸黏膜免疫調節異常可導致常見結腸息肉的發生。輔助性 T 細胞(helper T cells,Th細胞)及相關因子的調節參與黏膜炎癥的多種免疫應答，傳統觀點認為結腸相關病變主要是由Th1細胞分泌的干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)介導，與Th2細胞分泌的IL-4等細胞因子無關。近年來，國內外研究發現Th17細胞極化可能是炎癥性腸病的發病機制之一[5，6]。Th17細胞的分化調節在人源細胞或組織中與IL-1β和IL-6等細胞因子有關,Th17細胞分泌的IL-17可以清除特定的細胞外病原體,起到抗感染保護作用,與自身抗原的特異性結合又可導致炎癥性自身免疫疾病[7，8]。本研究篩選成都醫學院第一附屬醫院診斷為結腸息肉和潰瘍性結腸炎患者的病歷資料，收集實驗室檢查結果，在蛋白和轉錄水平上檢測外周血中輔助T細胞內外的相關細胞因子檢測,并進行相關的統計學分析，為臨床診療工作提供一定的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 酶聯免疫吸附試劑盒：人IFN-γ 酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒，人IL-4 ELISA試劑盒，人IL-17 ELISA試劑盒(購自北京達科為)；RNA的提取試劑盒：RNAprep Pure血液總RNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技有限公司)、逆轉錄試劑盒:HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR；qPCR預混液：ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixDNA聚合酶預混液(均購自南京諾唯贊生物科技有限公司)；流式抗體：均購自BioLegend公司，FITC anti-human CD4/PE anti-human IL-4/PE anti-human IL-17/PE anti-human IFNγ；佛波酯(PMA)購自Sigma公司，IFN-γ-F：GAGAACCCAAAACGATGCA，IFN-γ-R：ACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCG，IL-17-F：CAACCGATCCACCTCACCTT，IL-17-R：GGCACTTTGCCTCCCAGAT，IL-4-F：AACAGCCTCACAGAGCAGAAG-AC，IL-4-R：GCCCTGCAGAAGGTTTCCTT，ROR-F：GAGGAAGTGACTGGCTACCAGA，ROR-R：GCACAA-TCTGGTCATTCTGGCAG，T-bet-F：CCGTGACTGCC-TACCAGAAT，T-bet-R：TCATGCTGACTGCGCGAAA-C，GATA-3-F：AGGCAGGGAGTGTGTGAACT，GATA-3-R：TTTTTCGGTTTCTGGTATGG，以上引物均由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.1.2主要儀器 高速低溫離心機：SORVALL RC 6+Centrifuge購自ThermoFisher scientific；酶標儀：Multiskan Mk3購自Thermo SCIENTIFIC；流式細胞儀購自BD FACSCalibur，PCR儀購自美國HACH公司。

1.2方法

1.2.1研究對象 將2017年08月到2018年08月期間在成都醫學院第一附屬醫院就診的111例結腸病變患者納入研究，其中男性72例，女性39例，平均年齡(44.32±9.26)歲，其中結腸息肉患者60例，潰瘍性結腸炎患者51例，所有患者均經電子腸鏡檢查，近1個月內均無妊娠，無家族性遺傳病史。選擇同期45名健康體檢者作為正常對照組，其中男性26例，女性19例，平均年齡(43.18±7.73)歲，結腸息肉組、潰瘍性結腸炎組及正常對照組在年齡、性別構成上差異均無統計學意義(P>0.05)，本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2.2ELISA檢測外周血相關細胞因子蛋白表達水平 采集健康人群及患者清晨空腹外周血3～5 ml，非抗凝采血管，ELISA方法檢測外周血血清各細胞因子的含量，并進行分析。使用前，充分混合所有試劑，避免產生泡沫。加樣：100 μl/well 加入稀釋后的 Cytokine standard 至標準品孔，100 μl/well 加入樣品至樣品孔，100 μl/well加 Dilution buffer R (×1)入空白對照孔。蓋上封板膜，室溫(18～25℃)孵育2 h。洗板：扣去孔內液體，300 μl/well 加入 1×washing buffer；停留1 min后棄去孔內液體。重復3次。加檢測抗體：100 μl/well 加入稀釋后的 Biotinylated antibody。蓋封板膜，室溫孵育1 h。加酶：100 μl/well 加入 Streptavidin-HRP。蓋上封板膜，室溫孵育30 min。顯色：100 μl/well 加入TMB，室溫避光溫育5～30 min，根據孔內顏色的深淺(深藍色)來判定終止反應。終止反應：100 μl/well加入 Stop solution 終止反應。讀板：終止后用檢測波450 nm和校正波長630 nm。將零孔設為對照。根據標準曲線和稀釋倍數計算濃度。

1.2.3流式細胞術檢測外周血Th1/Th17/Th2細胞亞群 全血中加入適量的PMA后混勻，于5%CO2孵箱中37℃放置2～4 h。每管加入紅細胞裂解液避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，洗滌細胞后重復離心。加入適量FITC-CD4抗體,室溫下避光孵育20 min，洗滌離心后加入固定劑，室溫避光孵育20 min離心，棄上清，加入打孔劑，再洗滌。分別加入PE-IL-4/PE-IL-17/PE-IFNγ，避光孵育20 min，洗滌重懸，上機進行檢測。

1.2.4RT-PCR檢測外周血Th細胞分化相關轉錄因子和細胞因子的表達 人外周血總RNA的提取：全血中加入紅細胞裂解液后冰上孵育15 min，在孵育中渦旋振蕩混勻2次。 4℃ 2 100 r/min離心10 min后去上清。 向白細胞沉淀中加入紅細胞裂解液重懸細胞，再離心去除上清。向白細胞沉淀中加入裂解液RL，重懸后將溶液轉移至過濾柱CS中，12 000 r/min離心2 min，棄去過濾柱CS，收集濾液。向濾液中加入1倍體積70%乙醇混勻，得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR2中，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放回收集管。向吸附柱CR2中加入去蛋白液RW1，12 000 r/min離心30～60 s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。再向吸附柱CR2中央加入DNase Ⅰ 和去蛋白液RW1，離心后倒掉廢液，再向吸附柱CR2中加入漂洗液RW，室溫靜置2 min后離心，重復漂洗1次。將吸附柱CR2轉入新的RNase-Free離心管中，加入RNase-Free ddH2O室溫放置2 min，離心后得到RNA。

RNA逆轉錄和qPCR：RNA逆轉錄反應體系：模板RNA：1 pg～1 μg；5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix：4 μl；加RNase free ddH2O至總體積為20 μl。反應條件：50℃ 15 min,85℃ 5 s。 qPCR反應體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl；Primer1 (10 μmol/L) 0.4 μl，Primer2 (10 μmol/L) 0.4 μl，Template DNA/cDNA(模板體積不超過反應總體積的1/10)，加ddH2O至總體積為20 μl。反應條件：預變性 95℃ 30 s；循環反應：95℃ 10 s，60℃ 30 s；融解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

2 結果

2.1正常人群和結腸病變患者外周血中Th細胞相關細胞因子的表達水平 和健康人群相比，結腸息肉組血清中的IL-4表達量低于正常對照組(P=0.031)，而潰瘍性結腸炎的表達量高于正常對照組(P=0.038)，差異均具有統計學意義，兩結腸病變組別之間無差異(P=0.256)。健康人群IL-17的表達量為(6.017±1.527)pg/ml，和兩結腸病變組相比，差異均無顯著的統計學意義，其中潰瘍性結腸炎組的表達量為(6.741±1.766)pg/ml(P=0.293)，潰瘍性結腸炎組的表達量為(5.426±1.633)pg/ml(P=0.484)。IFN-γ的結果提示，相比較健康人群，結腸息肉組和結腸炎組的表達均顯著升高，差異具有明顯的統計學意義。其中結腸息肉組表達量為(4.045±1.874)pg/ml(P=0.049)，結腸息肉組的表達量為(5.815±2.955)pg/ml(P=0.015)(圖1、表1)。

圖1 各組血清中細胞因子的表達水平Fig.1 Level of cytokines in serum of each groupNote:*.P<0.05;NS.No significant.

表1 各組外周血Th細胞相關細胞因子表達水平pg/ml)

流式細胞術分析外周血Th細胞亞群分布，發現結腸息肉組CD4+/IL-4+T細胞百分比與正常組相近，而潰瘍性結腸炎患者的比例顯著升高，[P=0.003，(10.198±2.325)% vs (1.126±0.285)%]，具有統計學意義。和健康人群相比，潰瘍性結腸炎組CD4+/IL-17+T細胞百分比升高趨勢明顯[P=0.009，(9.152±1.932)% vs (1.785±1.066)%]，具有顯著的統計學差異。外周血CD4+/IFN-γ+的T細胞比例在正常組和結腸病變組中的差異均無統計學意義(圖2，表2)。

圖2 各組血清中細胞因子的表達水平Fig.2 Level of cytokines in serum of each group

表2 各組外周血中Th1/Th17/Th2細胞亞群的百分比

2.2性別對結腸病變患者的Th細胞相關細胞因子水平的影響 結果提示：結腸息肉女性患者的血清中IL-4、IL-17水平略高于男性患者，差異均無顯著統計學意義(P>0.05)；女性患者血清中IFN-γ的表達量相較于男性患者有所降低，差異無統計學意義。潰瘍性結腸炎女性患者和男性患者血清中IL-4、IFN-γ表達水平相似；而女性患者的血清中IL-17的表達水平低于男性患者，差異具有統計學意義(P=0.035)(圖3)。

圖3 不同性別的結腸病變患者血清中細胞因子的表達水平Fig.3 Level of cytokines in serum of colonic disease patients in different sexNote:*.P<0.05;NS.No significant.

如表3所示：正常人群外周血Th1/Th17/Th2細胞比例無顯著的性別差異；在結腸息肉患者中，男性患者外周血CD4+/IL-4+T細胞百分比高于女性患者，而CD4+/IL-17+T細胞百分比在女性患者中有所升高，兩者差異均無顯著的統計學意義，CD4+/IFN-γ+T細胞的百分比在男性和女性患者中相似；潰瘍性結腸炎女性患者外周血CD4+/IL-17+T細胞百分比顯著高于男性患者[P=0.022，(12.356±3.862)% vs (8.503±2.748)%]，差異具有統計學意義，性別對CD4+/IL-4+T細胞和CD4+/IFN-γ+T細胞百分比無顯著影響。

表3 各組外周血Th1/Th17/Th2細胞的不同性別中的分布Tab.3 Distribution of Th1/Th17/Th2 cells in different sex in peripheral blood of each group

2.3外周血中Th細胞相關細胞因子在轉錄水平的表達情況 通過RT-PCR檢測發現，結腸息肉組IL-4的mRNA相對表達量低于正常對照組(P=0.028)，潰瘍性結腸炎組別高于正常對照組(P=0.009)，差異均具有統計學意義。結腸息肉組IL-17 mRNA水平為(0.376±0.047)，相較于正常人群降低(P=0.025)；而潰瘍性結腸炎IL-17 mRNA水平為(46.171±10.328)，相較于正常人群顯著升高(P=0.004)。和正常人群相比，外周血IFN-γ的mRNA水平在結腸息肉組中為(1.184±1.191)(P=0.049)，潰瘍性結腸炎組中為(5.815±2.955)(P=0.008)，差異均具有統計學意義(圖4，表4)。

圖4 各組外周血中IL-4/IL-17/IFN-γ和GATA-3/RORγt/T-bet轉錄因子的相對表達量Fig.4 Relative expression of IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood of each group and GATA-3/RORγt/T-betNote:*.P<0.05;**.P<0.01.

表4 各組外周血中Th細胞相關細胞因子mRNA相對表達量

檢測與輔助性T細胞分化相關的轉錄因子，發現結腸息肉患者GATA-3/RORγt的mRNA相對表達量均與正常人群相似；T-bet的mRNA水平在結腸息肉和潰瘍性結腸炎中分別為0.687±0.882和1.835±0.987，均與正常對照差異無統計學意義；潰瘍性結腸炎中，GATA-3/RORγt的mRNA相對表達量均顯著升高，其中GATA-3的mRNA水平為26.530±3.270，RORγt的mRNA水平為38.257±7.680，相較于正常人群差異均具有顯著的統計學意義(GATA-3:P=0.001 2，RORγt：P=0.002 6)，(圖4，表5)。

表5 各組外周血中Th細胞分化相關轉錄因子mRNA相對表達量

2.4Th細胞相關細胞因子和中心粒細胞/單核細胞比值的相關性分析 正常人群和結腸息肉、潰瘍性結腸炎患者外周血中性粒細胞/淋巴細胞的比值分別為2.002±0.479，3.267±1.115，3.228±0.883，結腸病變患者中性粒/淋巴細胞比值均顯著高于正常人群，差異具有顯著的統計學意義(P=0.012，P=0.003，圖5)。分別對兩種結腸病變組外周血IL-4、IL-17、IFN-γ的mRNA水平和外周血中性粒/淋巴細胞進行相關性分析，其中：IFN-γ的mRNA水平在結腸息肉、潰瘍性結腸炎組中與外周血中性/淋巴比值均呈正相關(r=0.580；r=0.735，圖6)；結腸息肉患者IL-17水平與外周血中性/淋巴細胞比值呈現負相關的趨勢(r=0.718)，潰瘍性結腸炎患者中為正相關(r=0.744)；兩種結腸病變患者IL-4水平和外周血中性/淋巴細胞比值差異無顯著的統計學意義(結腸息肉組：r=0.085；潰瘍性結腸炎組：r=0.302)。

圖5 各組外周血中中性粒細胞和淋巴細胞的比值Fig.5 Ratio of neutrophils and lymphocytes in peripheral blood of each groupNote:**.P<0.01;***.P<0.001.

圖6 外周血中性粒/淋巴細胞的比值和IL-4、IL-17、IFN-γ的相關性分析Fig.6 Correlation analysis of neutrophils/lymphocytes ratio and IL-4,IL-17,IFN-γ in peripheral blood

3 討論

我院結腸息肉患者常見于中老年人群，且出現反復發作病情多變的特點，由于目前我國中老年人結腸鏡檢查普及率較低，尋找簡便快捷的檢驗手段可有效輔助監測結腸病變患者的治療效果及病情變化。潰瘍性結腸炎臨床表現為黏液血便，腹痛，是難治性腸道疾病之一，給患者及家屬帶來一定的精神壓力，輔助性T細胞亞群在UC的發病機制中起到關鍵作用[9]。基于此，本研究針對Th細胞免疫相關細胞因子在兩種常見結腸病變外周血的表達情況進行探討。Th1細胞是最早被發現的Th細胞亞群，抗原呈遞細胞分泌干擾素后作用于原始T細胞的STAT-1，再激活特異性轉錄因子T-bet，促使原始T細胞向Th1分化。Th1細胞分泌的促炎因子主要為IL-6、IFN-γ，研究表明Thl細胞在介導炎癥腸病中起關鍵作用。促炎反應常局限在腸黏膜局部，遷移至血液循環中導致全身炎癥反應的研究甚少；IFN-γ主要由T淋巴細胞和NK細胞分泌，能夠抗病毒和抗寄生蟲感染，調節免疫細胞增殖和凋亡，雙向調節炎癥因子的表達[10]。本研究探究結腸息肉和潰瘍性結腸炎患者外周血中Th1細胞內外IFN-γ的表達水平，發現：潰瘍性結腸炎患者血清中IFN-γ水平高于結腸息肉患者，其蛋白水平和轉錄水平的表達較為一致，而胞內IFN-γ表達量和T-bet轉錄水平在潰瘍性結腸炎中有所下降，提示在潰瘍性結腸炎中胞外升高的IFN-γ可反饋調節Th1細胞的分化,需進一步探究調節機制。結腸息肉的血清IFN-γ水平升高程度低于潰瘍性結腸炎，可能與結腸組織的病理類型和病程進展的分期有關，如腺瘤樣結腸息肉患者外周血IFN-γ水平反復升高，提示疾病有復發可能[11]。

Th2細胞也是較早發現的Th細胞亞群之一，當抗原呈遞細胞分泌IL-4作用于原始Th細胞表面受體后，被激活的STAT6活化特異性轉錄因子GATA-3，使原始Th細胞向Th2細胞分化。Th2主要分泌IL-4、IL-13等細胞因子。IL-4主要由活化的T淋巴細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞分泌，是一種多向性的免疫調節細胞因子，并且在體內外有一定的抗腫瘤活性[12]。有研究證實IL-4能夠抑制Th1細胞的活化，另有學者發現Th1型炎癥小鼠模型中用IL-4干預后出現炎癥加重的現象，提示IL-4可雙向調節Th1反應。本研究中結腸病變患者血清中IL-4水平在不同類型的腸病中具有各自的特點：在潰瘍性結腸炎患者中，雖然血清中IL-4含量較低，但是Th細胞胞內分泌的IL-4顯著升高，同時轉錄因子GATA-3表達量顯著上調，提示在外周血微環境中，免疫調節主要集中在Th2細胞的分化，其中不排除IL-4對Th1細胞的競爭抑制作用；結腸息肉患者的Th2型免疫應答在細胞內外均受到微弱的抑制。

Th17細胞有助于闡述Th1/Th2細胞分化增殖的異常現象和炎癥性腸病發生發展中的病理差異。IL-17是Th17細胞發生發展的主要效應因子，能夠聯合獲得性與先天性免疫系統來促進炎癥發生。有研究發現：IL-17在體內外具有多種生物學活性,通過誘導促炎因子(如IL-6)、化學因子(如MCP-1、MIP-2)以及基質金屬蛋白酶等促進組織炎癥發生[13]。另有研究表明IBD患者的腸黏膜組織中IL-17的表達明顯高于正常對照，并且病理組織局部表達高于正常組織；IL-17可促使腸上皮細胞分泌IL-6、IL-8中和IL-17的表達，抑制炎癥的發生；也有研究發現抑制IL-17表達反而使炎癥加重，可為一種雙向調節機制[14]。

本研究中結腸病變組血清中IL-17的含量和健康人群相比無顯著差異，但是在轉錄水平上和IL-4的變化趨勢相似，在結腸息肉組中低于正常人群，而在潰瘍性結腸炎中顯著高于正常人群；可能為不同病理類型的炎癥環境有差異，抑或外周血微環境中參與其他Th細胞的激活和分化。是否存在Th2細胞和Th17細胞的相互調節需要進一步驗證。潰瘍性結腸炎患者中Th17細胞比例顯著升高，分化相關的轉錄因子RORγt表達量也保持較高的水平，這些高表達的Th17細胞在機體循環的趨化途徑值得進一步探討。近年研究發現IL-17主要在結直腸癌組織和腸黏膜固有層淋巴細胞內表達，可上調腫瘤細胞的血管內皮生長因子[15-18]，而潰瘍性結腸炎是結腸癌的危險因素之一，研究Th17細胞功能為基于腫瘤血管生成的腫瘤免疫治療提供治療。目前對于性別影響外周血IL-17的表達水平的研究甚少，曾有報道在無癥狀的女性淋病患者胸腺基質中，淋巴細胞生成素與宮頸分泌物的IL-17表達水平呈負相關，本研究中潰瘍性結腸炎女性患者外周血IL-17胞內表達水平低于男性患者，性激素是否影響外周血的Th17細胞的分化有待進一步探討。

外周血中單個中性粒細胞產生的細胞因子遠少于單個核細胞，當機體處于炎癥狀態，中性粒細胞數量明顯超過單個核細胞，便具有重要的病理意義。中性粒細胞不僅受促炎因子影響，一定刺激下也可產生多種細胞因子，包括IL-8、TNF-α、巨噬細胞炎癥蛋白、IL-1β、IL-10、集落刺激因子等。本研究中，兩種結腸病變患者外周血中IL-4的mRNA水平與中性/淋巴比例的相關性較弱，可能與IL-4多向性的免疫功能有關，后續研究中，分析腸系膜淋巴結的Th細胞更有助于綜合評估Th細胞的系統性免疫應答。IL-17參與中性粒細胞的增殖、成熟和趨化作用，本研究中結腸病變組的IL-17在轉錄水平上和外周血中性粒細胞的數量存在較強的相關性：結腸息肉中，中性粒細胞分泌的IL-8等在轉錄水平上抑制了Th17細胞的增殖；潰瘍性結腸炎中，IL-17隨著中性粒細胞增多而表達增強，發揮促炎作用，體現了其雙向調節功能。輔助性T細胞在炎性結腸病變患者中的作用機制目前尚不明確，但可以初步判斷Th1/Th17/Th2細胞在外周血中相互調節、相互抑制，分泌的多種細胞因子是一個動態平衡過程，其中Th17細胞更易發揮雙向調節作用。炎癥性結腸病變病因復雜，其發生發展與輔助性T細胞的分化方向和細胞因子網絡失衡有一定聯系，深入探討Th細胞的免疫微環境的調節，揭示其免疫發病機制，可為預測疾病的進程及合理用藥提供新思路。