NLRP3、PYCARD、CASP1在痛風性關節炎患者中的變化特點及其臨床意義①

張志明 齊張旸 徐叢榮 黃青青 趙鐘文 吳寬裕 陳煜宇 王亮萍 吳方真

(福建中醫藥大學附屬第二人民醫院風濕免疫科，福州 350003)

痛風是一種尿酸鹽結晶沉積在關節滑膜、滑囊、軟骨及其他組織引起的晶體相關性疾病，以反復發作的痛風性急性關節炎、皮下痛風石、痛風性腎病、尿路結石為主要臨床表現，嚴重時可致關節畸形和功能障礙。本病好發于40～50歲中年男性，是最常見的炎癥性關節炎，我國的患病率約為 1.1%。患者多在夜間發病，病損部位可出現紅、腫、熱和壓痛感，還會伴隨全身無力、發熱、頭痛等癥狀[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體3(NLRP3)、半胱天冬酶-1(CASP1)、凋亡相關斑點樣蛋白(PYCARD)均與炎癥反應存在一定關聯[2]。研究選取我院確診的90例GA患者(GA組)及健康體檢志愿者(對照組)，采用RT-PCR技術檢測兩組NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平，分析各指標與GA患者血清炎癥因子之間的關系，現報告如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 選取我院2016年2月至2017年4月確診的90例GA患者(GA組)、選取健康體檢志愿者90例(對照組)。GA組，年齡36～78歲，平均(57.5±13.0)歲，男79例、女11例，體重指數(BMI)(22.6±2.4)kg/m2，其中急性GA患者60例(AGA組)、非急性期GA患者30例(NAGA組)。對照組，年齡33～79歲，平均(58.0±15.2)歲，男75例、女15例，體重指數(BMI)(22.4±2.8)kg/m2。兩組研究對象的年齡、性別、BMI比較，差異不具有統計學意義(t=-0.237、P=0.813，χ2=0.719、P=0.396，t=0.514、P=0.608)。

1.1.2納入標準 ①GA患者的診斷標準參考2015年美國風濕病協會(ACR)/歐洲抗風濕病聯盟制定的診斷標準[3]；②患者年齡范圍19～79歲；③對照組為體檢健康志愿者；④本研究獲得患者本人的知情同意，經我院醫學倫理委員會的批準。

1.1.3排除標準 ①惡性腫瘤；②血液系統疾病；③伴有嚴重的精神疾病、認知功能障礙；④免疫功能缺陷；⑤腦血管疾病；⑥甲狀腺功能疾病；⑦心肌梗死、心衰、心瓣膜疾病等；⑧嚴重的肝腎功能疾病。

1.1.4口服藥物 秋水仙堿片(生產企業：西雙版納版納藥業有限責任公司，批準文號：國藥準字H53021369)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR技術 兩組患者均取外周靜脈血3 ml，立即置入含有肝素鈉的抗凝管中。將外周血單個核細胞無菌分離，用Trizol試劑(生產廠家：Invitrogen 公司)，嚴格按說明書操作提取總RNA，加入30 μl無RNA酶水溶解RNA，在取5 μl RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，在瓊脂糖凝膠圖譜中顯示28S、18S、5S 三條帶，計算 A260/A280，只采用比值范圍在1.8～2.0者。cDNA的合成則嚴格按照逆轉錄試劑說明書操作，所選參數為37℃ 15 min，85℃ 5 s 終止反應。將產物cDNA在-20℃條件下保存，作備用。

以對照組和GA組的cDNA建立25 μl的反應體系，對此進行PCR擴增，將擴增所得產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠中加入Green-View核酸染料，后將瓊脂糖凝膠用FUSION-Fx5曝光機進行曝光拍攝，曝光機由北京五洲東方科技發展有限公司生產。對曝光所得的PCR目的條帶圖進行灰度值測定，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達量由NLRP3、PYCARD、CASP1灰度值比內參灰度值表示。

1.2.2血清炎癥因子檢測 檢測AGA組、NAGA組患者的血清IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。

患者抽取靜脈血3 ml，將得到的血液立即放入含促凝劑的試管中，靜置30 min，離心3 min，取適量血清對IL-6、TNF-α進行測定，兩種指標均采用ELISA方法進行測定，IL-6 ELISA試劑盒來自上海百蕊生物科技有限公司，TNF-α ELISA試劑盒則來自上海基免實業有限公司，上述操作樣按照試劑盒說明書進行。

1.2.3治療方法 依據2016年中國痛風診療指南治療患者[4]，在低嘌呤飲食、足量飲水前提下，急性發作期在癥狀出現 12 h內服用秋水仙堿片(劑量1 mg，1 h后服用0.5 mg)和 (或)非甾體類抗炎藥 (NSAIDs)( 如果需要加用質子泵抑制劑)，口服糖皮質激素 ( 潑尼松 30～35 mg/d 使用 3～5 d) 或抽取關節液并注射糖皮質激素，具體治療方案根據患者病情個性化調整。非急性期根據患者病情，繼續逐漸降低血尿酸水平，減少血尿酸突然大幅度波動，防止痛風石形成，終生維持患者血尿酸水平<360 μmol/L，對于嚴重痛風患者血尿酸水平<300 μmol/L。采用小劑量別嘌呤醇開始，以100 mg/d開始，每2～4周加量100 mg，以達到目標水平，且注意治療過程中尿酸監測，配合預防治療，囑避免高嘌呤飲食。

2 結果

2.1治療前GA組和對照組的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較 GA組患者治療前的NLRP3 mRNA表達水平低于對照組(P<0.05)，GA組患者的PYCARD、CASP1 mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 GA組和對照組的NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較

2.2治療前不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較 治療前不同GA組患者比較，AGA組患者的NLRP3、CASP1 mRNA表達水平高于NAGA組(P<0.05)，而PYCARD mRNA差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同病情GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較

2.3治療前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較 GA組患者的治療后的NLRP3 mRNA水平顯著升高且差異具有統計學意義(P<0.05)，CASP1 mRNA、PYCARD mRNA表達水平在治療后顯著降低且差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 治療前后的GA患者NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平比較

2.4治療前不同病情GA患者炎癥 指標水平比較 AGA組患者的IL-6表達水平低于NAGA組(P<0.05)，而TNF-α差異不具有統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 不同病情GA患者炎癥指標水平比較

2.5GA患者治療前炎癥指標與NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平相關性 治療前，GA組患者的NLRP3 mRNA 與IL-6、TNF-α呈負相關，且具有統計學意義(P<0.001)；PYCARD、CASP1 mRNA與GA患者的IL-6、TNF-α呈正相關，且具有統計學意義(P<0.001)，見表5。

表5 相關性分析結果Tab.5 Correlation analysis results

3 討論

痛風性關節炎的病因主要是體內尿酸過多，在痛風性關節炎患者體內長期存在嘌呤代謝障礙，該過程導致嘌呤的最終代謝產物尿酸增高，血中尿酸濃度高于正常值，醫學上稱為“高尿酸血癥”[1]。當血中尿酸濃度超過飽和溶解度時就會析出成為結晶體，在軟組織或關節中積存，使身體出現炎癥反應。痛風性關節炎也與飲食、天氣變化及外傷等多方面的因素密切相關[4]。痛風性關節炎患者可能會出現痛風石、整個關節呈暗紅色、高尿酸血癥、非對稱性關節腫痛等現象[5,6]。常用治療方式主要為藥物治療，急性期患者可選用非甾體抗炎藥、秋水仙堿、糖皮質激素進行治療，緩解期主要以抑制尿酸生成和促進尿酸排泄為目的使用藥物，無癥狀高尿酸血癥的治療主要包括減肥、控制血脂、減少非必要的利尿劑應用、控制飲食等[4]。

NLRP3的基因多態性與痛風性關節炎的關節狀態、遺傳易感性及藥物治療效果均有密切關系，主要起到調控CASP1 的作用，NLRP3 與CASP1 可形成NLRP3炎癥體，發揮調控機體炎癥反應的作用[7-9]。CASP1 主要通過多條信號通路參與細胞炎癥及凋亡，調節細胞存活與死亡的平衡[10]。PYCARD是炎癥復合體中重要的接頭分子蛋白，主要是通過自身的寡聚化來集中上游受體蛋白和下游炎癥相關蛋白，進而形成一個炎癥復合體[11]。PYCARD與炎癥相關的CASP1 所組合成的復合物，在天然免疫中發揮著重要的作用，此外PYCARD還參與了NLRP3炎癥復合體的形成[12]。目前，NLRP3 mRNA水平在治療前后的變化尚有爭議，有文獻報道治療后NLRP3 mRNA水平顯著降低，亦有學者報道治療后NLRP3 mRNA水平較治療前顯著升高[7,13]。我們的研究證實，GA組患者治療后NLRP3 mRNA水平顯著升高且差異具有統計學意義，與部分學者報道的結果一致[5,7]。目前關于造成上述結果的原因尚不清楚，可能與患者的具體診療方案有關，亦可能與NLRP3基因多態性存在一定聯系，但其機制仍有待進一步探討。另外，本研究證明，CASP1、PYCARD mRNA表達水平在治療后顯著降低且差異具有統計學意義，說明經過治療后GA組患者痛風改善與體內的炎癥反應下降存在一定關系，但炎癥反應與痛風改善之間的因果關系仍有待進一步研究。

GA組患者的NLRP3 mRNA表達水平低于對照組，而PYCARD、CASP1 mRNA表達水平高于對照組，該結果提示NLRP3基因表達在炎癥反應中呈現負性調節效果，而PYCARD、CASP1可能在GA發病起中發揮促進作用。 AGA組患者的NLRP3、CASP1 mRNA表達水平高于NAGA組，而PYCARD mRNA差異不具有統計學意義，提示通過檢測NLRP3、PYCARD、CASP1的表達可能有助于判斷GA的分類，選擇最佳治療藥物與用藥療程。

單核巨噬系統在急性痛風性關節炎(AGA)發生發展中具有重要意義，此階段涉及IL-6、TNF-α等多種炎癥因子，在發病過程中患者體內的IL-6水平上升，進入機體循環中，機體呈現全身急性時相反應，進而出現發熱、身體不適等現象[14]。TNF-α具有主導炎癥因子的作用，對炎癥因子具有促進效果[15]。AGA組患者的IL-6、TNF-α表達水平高于NAGA組，該結果說明IL-6、TNF-α在AGA發病密切相關。GA組患者的NLRP3 mRNA 與IL-6、TNF-α呈顯著的負相關關系，PYCARD、CASP1 mRNA與GA患者的IL-6、TNF-α呈顯著的正相關關系，即各指標之間均存在密切聯系，在臨床中可通過結合各項指標對GA的病情進行判斷，也提示我們PYCARD、CASP1的表達在GA各種炎癥因子的釋放和成熟過程中的重要性。

綜上所述，NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平變化與GA患者病情變化及炎癥反應程度之間存在密切關聯。通過檢測NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達有助于評估患者病情，指導后續治療。通過調節NLRP3、PYCARD、CASP1 mRNA表達水平可能是GA治療的新靶點。