TAP1-637/LMP7-145基因多態性與漯河市農村婦女宮頸高危型HPV感染相關性研究①

宋佳玉 張清偉 孫明振 于江華 劉金寶 王慧芬 付秀虹

(漯河醫學高等專科學校,漯河 462002)

高危型人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是導致宮頸病變的首要病因，但大多數的HPV感染為一過性，僅少部分高危型HPV持續感染導致宮頸病變[1,2]。因此，宿主自身的免疫遺傳因素在高危型HPV感染的發生和轉歸中起著重要作用[3]。抗原呈遞通路作為機體自身的免疫監視系統，在機體防御高危型HPV入侵的過程中發揮重要作用[4-6]。抗原處理相關轉運體(Transporter associated with antigen processing,TAP)和低分子量蛋白酶體(Low molecular weight polypeptide,LMP)作為該通路的關鍵位點基因多態性，是否與高危HPV感染存在相關性目前鮮有報道。本研究首次對漯河市農村婦女TAP1-637和LMP7-145多態位點進行檢測，探討其與高危HPV感染的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年9月～2017年12月漯河市農村婦女免費宮頸癌篩查中，確診為高危HPV感染者258例和未感染者228例為研究對象，將其分為感染組和對照組。納入標準：年齡25～65歲，性生活史>3年；月經干凈3 d以上；取樣前72 h無性生活及陰道用藥；排除標準：無性生活史；既往診斷有宮頸病變史；有免疫性疾病、移植、惡性腫瘤放療史；子宮已切除。本研究經河南省漯河市漯河醫學高等?？茖W校第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象知情并均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1現場調查 采用專門設計的調查表對研究對象進行現場調查，內容包括年齡、種族、初產年齡、孕次和產次等方面情況。

1.2.2HPV檢測方法 采用專用HPV采樣器采集宮頸HPV標本。按照15種型別HPV測試劑盒(江蘇中生方政生物技術股份有限公司)說明書，對15種高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)DNA行半定量檢測。陰性者為對照組，陽性者為高危HPV感染組。

1.2.3DNA提取 抽取外周靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸(Elhylene dia mine tetraacetic acid,EDTA)抗凝，-80℃保存。按照TaKaRa全血DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)操作進行。

1.2.4引物設計 引物序列由武漢生物工程公司合成。見表1。

表1 設計引物Tab.1 Primer Design

1.2.5基因多態性檢測 在聚合酶鏈反應(Polym-erase chain reaction,PCR)儀(ABI-9700，天津金思德生物科技有限公司)中進行PCR擴增反應，PCR擴增體系為20 μl，DNA模板2 μl(30 ng/μl)，2×PCR Taq Mix 10 μl(TaKaRa)，正反向引物各0.5 μl(10 μm/μl)，ddH2O 7 μl(日本TaKaRa Bio 株式會社)。PCR擴增條件：95℃預變性3 min，98℃變性5 s，退火30 s，退火溫度分別為56℃、60℃，72℃延伸40 s，共30個循環，最后72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳儀(DYCP-31BN，北京六一生物科技有限公司)檢測結果。PCR產物送至安徽通用生物公司，應用Sanger測序法對TAP1-637和LMP7-145單核苷酸多態性位點進行基因分型檢測。

2 結果

2.1研究對象基本情況 兩組在年齡、種族、初產年齡、孕次和產次等方面差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 研究對象基本情況Tab.2 Basic dates of research object

2.2Hardy Weinberg平衡檢驗 經吻合度檢驗TAP1-637、LMP7-145兩位點的基因型分布在各組均符合Hardy Weinberg平衡定律(感染組：P=0.245，對照組：P=0.351；感染組：P=0.817，對照組：P=0.792)，表示所選取的樣本具有群體代表性，即所選取的樣本能夠代表河南省漯河市農村婦女的基因型分布。

2.3TAP1-637、LMP7-145多態性位點基因型 PCR擴增產物分別為405 bp、351 bp，其電泳圖及多態位點測序結果見圖1、2。

圖1 TAP1-637、LMP7-145擴增產物電泳圖Fig.1 Eelectrophoretogram of PCR products of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:M.DNA Maker；Lane 1-8.The PCR products of locus TAP1-637 was 405 bp；Lane 9-16.The PCR products of locus LMP7-145 was 351 bp.

圖2 TAP1-637、LMP7-145基因位點測序圖Fig.2 Direct sequencing graph of locus TAP1-637 and LMP7-145Note:The arrow pointed to the polymorphism of locus rs TAP1-637 and LMP7-145.①.TAP1-637 genotype AA;②.TAP1-637 genotype AG;③.TAP1-637 genotype GG;④.LMP7-145 genotype GG;⑤.LMP7-145 genotype GT;⑥.LMP7-145 genotype TT.

2.4TAP1-637等位基因和基因型頻率 TAP1-637位點的A、G等位基因的頻率在對照組和感染組中分別為82.2%、17.8% 和82.1%、17.9%，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；AA、AG、GG基因型頻率分布在對照組(65.8%、32.9%和1.3%)和感染組(65.5%、33.3%和1.2%)間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 漯河市農村婦女TAP/LMP基因多態性分布情況Tab.3 Comparison of polymorphism distribution of locus TAP/LMP gene in in rural women in Luohe city

2.5LMP7-145等位基因和基因型頻率 LMP7-145位點的G、T等位基因的頻率在對照組和感染組中分別為82.7%、17.3% 和82.9%、17.1%，兩組間差異無統計學意義(P>0.05)；GG、GT、TT基因型頻率分布在對照組(67.5%、30.3%和2.2%)和感染組(68.2%、29.5%和2.3%)間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.6TAP1-637和LMP7-145位點單倍型分析 Haploview軟件進行聯合分析，結果顯示存在連鎖不平衡現象(D′=1.0，r2=0.5)，見圖3。TAP1-637、LMP7-145的單倍型分析結果顯示，對照組中單倍型GA頻率為64.4%，GG為17.7%，TA為17.9%。與GA單倍型相比，GG、TA單倍型均與高危HPV感染風險無關(P>0.05)。見表4。

圖3 TAP1-637、LMP7-145位點連鎖不平衡分析Fig.3 Association between locus TAP1-637 gene and LMP7-145 detected by linkage disequilib-rium analysis

表4 TAP1-637、LMP7-145位點單倍型在對照組和感染組的比較Tab.4 Comparison of genotype of locus TAP1-637 and LMP7-145 gene in cervical high-risk HPV infection group and healthy control

3 討論

高危HPV感染是宮頸癌及癌前病變的主要病因，且具有明顯的區域性[7]，本研究選擇漯河市農村婦女為研究對象，農村居住地人口相對穩定，少與外界通婚，流動性小，人群間生活方式及遺傳背景較一致，能更好地突出地域性特點。另外，大量的研究表明機體是否發生HPV感染與環境、生活方式、免疫、遺傳背景密切相關[8-10]，而目前免疫遺傳因素是當今研究的熱點[11]，因此本研究從免疫遺傳學角度出發，探討宮頸高危HPV感染的可能易感因素。

人類白細胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)即人類主要組織相容性復合物(Major histocompatibility complex,MHC)，作為機體的免疫遺傳背景，在控制病毒的感染、腫瘤細胞的發生過程中起著重要的作用。在MHC-Ⅱ類區域內存在低分子量蛋白酶體(LMP)和抗原處理相關轉運體(TAP)兩類重要基因。LMP可將內源性抗原肽進行降解，產生合適的C-端氨基酸殘基肽段，TAP可將肽段轉運到內質網腔中，與HLAⅠ類分子結合，形成穩定的HLA-Ag復合物然后呈遞到細胞表面被特異性細胞毒性T細胞(CTL)識別，產生特定的免疫應答反應。因而LMP和TAP被認為是調節自身免疫應答的關鍵因素。而LMP和TAP的多態性可使機體對內源性抗原肽有不同的識別力、親和力和轉運力，最終機體對內源性抗原肽免疫應答結果不同，免疫耐受、免疫保護或自身免疫。已有大量研究顯示，LMP和TAP基因多態性和HBV感染、HCV感染有關[12-14]。但目前對LMP和TAP基因多態性與高危HPV感染研究報道較少。

基于以上思路，并考慮到基因多態性具有區域性特點，本研究在抗原呈遞通路相關基因中選取了TAP1-637和LMP7-145兩個多態性位點，首次對河南省漯河市農村婦女高危HPV感染人群及健康人群進行基因多態性檢測，并進行易感性關聯分析?；蚨鄳B性結果分析顯示，TAP1-637和LMP7-145等位基因和基因型頻率在高危HPV感染組和健康對照組間差異無統計學意義，說明TAP1-637和LMP7-145的基因多態性對個體是否會高危HPV感染可能無影響。為了進一步的探討TAP1-637和LMP7-145基因多態性和高危HPV易感性的關系，本研究構建并分析了LMP/TAP單倍型，發現單倍體型在感染組和對照組間差異無統計學意義，進一步說明TAP1-637和LMP7-145的基因多態性可能和高危HPV易感性無關。

綜上所述，我們首次研究發現TAP1-637和LMP7-145的基因多態性與河南省漯河市農村婦女高危HPV感染可能不具有相關性。這種結果,可能是由于本研究納入病例數相對較少引起。 亦有可能是TAP1-637和LMP7-145對高危HPV感染的影響并非通過遺傳因素或單核苷酸基因多態性產生,也不排除與TAP、LMP基因其他位點多態性有關等。因此，TAP1-637和LMP7-145位點與漯河地區農村婦女宮頸高危HPV感染之間是否有關聯性，需要大樣本、多中心研究研究，進一步確定。