Alpha-synuclein自身抗體用作帕金森病抗體治療的探索研究

車環宇 趙凌志 倪 雪 滕國生 車 翀

(通化師范學院醫藥學院，通化 134002)

帕金森病是除阿爾茨海默病之外最常見的一種神經退行性疾病，主要癥狀表現在身體和精神兩方面，包括運動遲緩、震顫、肌強直、行走困難以及認知、睡眠和感覺障礙[1]。帕金森病的兩個突出病理學特征就是中腦黑質多巴胺神經元的死亡和缺失，以及多巴胺神經元胞質包涵體路易小體的出現[2,3]。多巴胺神經元在帕金森病發展過程中的重要作用已被諸多研究所證實，但由于神經元的損傷是不可逆轉的，對疾病的早期預防和治療無益，因此，越來越多的研究開始關注引起多巴胺神經元損傷的原因。研究發現，多巴胺神經元的損傷與路易小體的形成密切相關，而路易小體的主要組成部分就是alpha-synuclein (α-syn)[4]。α-syn和帕金森病相關聯的直接證據來自于α-syn蛋白中獨立氨基酸位點的突變會引起家族性帕金森病[5,6]。遺傳學證據表明，α-syn基因位點的復制同樣會導致帕金森病的早期發生[6,7]。此外，某些易引起帕金森病的高危常染色體基因位點，和一些家族性PD相關的隱性基因位點通常位于α-syn基因的上游，它們的突變會導致α-syn蛋白的累積和毒性作用的增強，從而造成家族性和散發性帕金森病[8-11]。

在疾病的發展過程中，α-syn單體蛋白受內外因素影響產生錯誤折疊，繼而發展成神經毒性較強的可溶性寡聚體，并最終聚合形成不溶的纖維前體和纖維體，從而引起腦內免疫紊亂，過度激活小膠質細胞釋放炎癥因子，損傷神經元細胞，導致帕金森病的產生[12-14]。因此，如何通過藥物來抑制α-syn聚合，并通過藥物介導α-syn聚合體在腦內的清除，就成為了預防和治療帕金森病的新方向。但由于α-syn單體結構的多變性和α-syn聚合過程的復雜性，導致通過傳統雜交瘤免疫和基因工程方法得到的抗體藥物靶向性不強且藥效不佳。為了獲得真正具有療效的帕金森病治療性抗體，本文通過從外周血中分離培養B細胞的方法，對外周血中B細胞分泌的α-syn自身抗體進行了生物學功能方面的探索研究。

1 材料與方法

1.1材料 生物安全柜、CO2培養箱、高速冷凍離心機、酶標儀和384孔酶標板購自Thermo公司。洗板機購自Biotek公司。倒置顯微鏡購自Olympus公司。96孔細胞培養板和酶標板購自Corning公司。臺盼藍染料和IMDM 完全培養基購自Hyclone公司。胎牛血清購自Gibco公司。TMB、吐溫-20購自Sigma公司。IL-2購自Sino biological公司。IL-21購自Thermo公司。無脂奶粉購自BD公司。慶大霉素購自Quality Biological公司。SepMateTM密度梯度離心管和EasySepTMHuman B Cell Enrichment 試劑盒購自Stem cell公司。Ficoll-Paque Plus購自GE公司。人α-synuclein單體、α-synuclein聚合體、β-synuclein、γ-synuclein和硫黃素T購自Abcam公司。羊抗人IgG Fc-HRP抗體購自Bethyl公司。

1.2方法

1.2.1人B細胞分離培養 首先按照Huang等[15]文章中提供的方法準備3T3-msCD40L滋養層細胞并凍存待用。健康人全血由捐贈者捐贈并通過項目倫理委員會批準。當獲得健康人全血后，通過SepMateTM密度梯度離心管，按照使用說明，從全血中分離人外周血單核細胞(PBMC)，并進行PBMC細胞計數。隨后使用EasySepTMHuman B Cell Enrichment試劑盒，按照試劑盒使用說明從PBMC中分離并富集B細胞，進行B細胞計數。計數后參照Huang等[15]文章中提供的方法，按照5 000個3T3-msCD40L滋養層細胞和4個B細胞每孔的密度鋪于120塊96孔細胞培養板中，并在每孔中加入200 μl 含104U/ml IL-2和100 μg/ml IL-21的IMDM完全培養基，將96孔板放置在37℃，5%CO2培養箱中靜置培養13 d，取上清進行ELISA檢測。

1.2.2ELISA檢測B細胞上清和人α-syn單體和聚合體蛋白的結合活性 用pH9.2的包被緩沖液分別稀釋α-syn單體和聚合體蛋白至1 μg/ml,以50 μl/孔包被于384孔酶標板，4℃孵育過夜。用110 μl/孔PBST(PBS+1%Tween-20)洗板1次后加入100 μl/孔的2% milk-PBS，在室溫下封閉2 h。洗板3次后加入B細胞培養上清(20 μl/孔)，在室溫條件下孵育1 h。隨后洗板3次，再加入2% milk-PBS稀釋10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗 (50 μl/孔)，室溫下孵育1 h。洗板6次后用TMB顯色試劑盒顯色(30 μl/孔)，在室溫條件下避光顯色5 min后加2 mol/L H2SO4(30 μl/孔)終止顯色。終止顯色后立即用酶標儀在波長450 nm處測OD值。

1.2.3ELISA檢測B細胞上清與人α、β、γ-synuclein蛋白家族的交叉實驗 用pH9.2的包被緩沖液分別稀釋α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein蛋白至1 μg/ml,包被于384孔板，4℃孵育過夜。洗板并封閉后加入B細胞培養上清(20 μl/孔)，在室溫條件下孵育1 h。洗板后加入2% milk-PBS稀釋10 000倍的山羊抗人IgG Fc-HRP二抗(50 μl/孔)，室溫下孵育1 h。洗板后加30 μl/孔TMB顯色液在室溫避光條件下顯色5 min，再加30 μl/孔H2SO4(2 mol/L)終止。隨后立即用酶標儀在波長450 nm處測OD值。

1.2.4硫黃素T(ThT)法檢測B細胞上清對α-syn單體聚合的抑制作用 參照Abcam提供的硫黃素T檢測法，將新鮮配制的終濃度分別為10 nmol/L的α-syn聚合體、100 μmol/L的α-syn單體、25 μmol/L的硫黃素T及50 μl B細胞上清或同型對照抗體(人IgG1)或空白對照(PBS緩沖液)混勻于PBS(pH7.4)緩沖液中，以100 μl/孔(2復孔)加于96孔酶標板中，將板密封后置于振蕩器上，以600 r/min的速率在室溫孵育24 h。隨后在酶標儀(激發光450 nm/發射光485 nm)上讀取熒光值，通過以下公式計算檢測的B細胞上清對α-syn單體聚合的抑制率，并通過graphpad6.0軟件對數據進行統計學分析。抑制率=[(ThTblank-ThTsup)/(ThTblank)]×100%。

2 結果

2.1B細胞上清和人α-syn單體和聚合體蛋白的結合活性 從外周血分離的B細胞培養13 d后，離心將約200 μl的B細胞上清按照同樣的順序轉到新的96孔板中用于ELISA和生物學活性檢測。首先通過ELISA檢測B細胞上清和α-syn單體蛋白的結合活性。ELISA共檢測10 530個樣品，其中OD450>0.5和OD450>1.0的B細胞上清樣品分別有48和22個(圖1A)。取α-syn單體蛋白結合OD450>0.5的48個上清樣品進行和α-syn聚合體蛋白結合活性的ELISA檢測，發現其中12個樣品表現出只和α-syn單體結合，而不和α-syn聚合體結合。因為本次檢測是基于α-syn單體檢測陽性的基礎上，因此所有剩余的36個樣品既可以結合α-syn單體，也可以結合α-syn聚合體(圖1B)。

圖1 ELISA檢測B細胞上清和α-syn單體和聚合體的結合活性Fig.1 ELISA test of binding of B cell supernatant to α-syn monomer and aggregateNote:A.48 in total 10 530 samples were able to bind to α-syn monomer and 36 of which bound to α-syn aggregate；B.There are 12 samples that bound to α-syn monomer only，but 36 samples bound to both α-syn monomer and α-syn aggregate.

2.2B細胞上清與人α、β、γ-synuclein家族蛋白的交叉結合活性 選取與α-syn單體和聚合體結合呈陽性的36個B細胞上清樣品，通過ELISA檢測上清樣品是否和α-syn家族蛋白β-syn和γ-syn結合，以確定待測的上清樣品是否具有α-syn結合特異性。檢測結果表明，所有檢測樣品均與α-syn結合，但不結合β-syn和γ-syn蛋白，表明檢測的上清樣品具有α-syn結合特異性。

2.3B細胞上清中α-syn自身抗體對α-syn聚合的抑制作用 選取與α-syn單體和聚合體結合呈陽性，且無家族蛋白交叉活性的36個B細胞上清樣品，通過硫黃素T法檢測B細胞上清中α-syn自身抗體是否具有抑制α-syn單體聚合的生物學活性。實驗結果表明，所檢測的36個樣品中有9個樣品(18B03、24D09、25G07、41H11、55F02、84C06、85F02、87C04、96C05)能夠抑制α-syn單體的聚合，且具有顯著的統計學意義(圖2)。其中如表1所示，25G07和55F02的抑制率可以達到50%。

圖2 硫黃素T法檢測B細胞上清中α-syn自身抗體對α-syn聚合的抑制作用Fig.2 Inhibition test of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant using ThT assayNote:*.P<0.05，**.P<0.01,****.P<0.000 1.

表1 所檢測的B細胞上清對α-syn聚合的抑制率(%)Tab.1 Inhibition ratio (%) of α-syn aggregation by α-syn autoantibody in B cell supernatant

3 討論

本文通過從外周血中分離培養B細胞并檢測B細胞上清中α-syn自身抗體和α-syn單體、聚合體、家族蛋白β-syn和γ-syn的結合，確認了外周血中α-syn自身抗體能夠特異地和α-syn單體和聚合體結合。通過抑制α-syn單體聚合的生物學活性檢測，發現α-syn自身抗體具有一定的生物學功能，在體外條件下能夠抑制α-syn單體的聚合，證明了α-syn自身抗體具有潛在的治療PD的應用價值。

在本研究中，出于B細胞存活率考慮，B細胞的鋪板密度維持在4個B細胞每孔。在早期研究中，嘗試過0.5、1和2個B細胞每孔的鋪板密度，但是過少的B細胞會造成細胞增殖困難。在2個B細胞每孔的鋪板條件下，B細胞增殖率(細胞增殖孔/總鋪板孔數)可以達到70%～80%，但后期上清IgG濃度檢測發現2個B細胞每孔的上清IgG濃度在10～80 ng/ml之間，抗體量不足以進行生物學活性檢測。即使在4個B細胞每孔的條件下，上清中的抗體量也不足以支撐9個生物學陽性樣品的進一步檢測。在后續實驗中，可以通過B細胞永生化的途徑，在篩選前期，即對α-syn結合陽性的B細胞進行Epstein-Barr virus(EBV)轉染，使B細胞成為可以持續分泌抗體的永生化細胞[16]。此外，也可以通過流式細胞儀對B細胞進行抗原特異性分選，收集能夠和α-syn抗原特異性結合的記憶B細胞，通過RT-PCR和測序的方法獲得抗體序列，進行質粒轉染和表達來獲得足量的抗體[17-20]。如果能夠獲得足夠的抗體，下一步可以繼續研究外周B細胞分泌的α-syn自身抗體是否可以介導α-syn聚合體在體內的清除，從而進一步分析α-syn自身抗體的生物學功能，為PD治療性抗體的研發打下基礎。此外，本研究所采集的血液樣本來自于健康人捐獻者，后期研究可以考慮應用不同年齡階層的健康人和PD患者。從而比較健康人和PD患者之間，以及不同年齡健康人群之間產生自身抗體的差別。這些差別將有助于分析自身抗體產生的機制，并深入研究PD疾病的發生機理，從而對PD抗體藥物的研發起到推動作用。

在其他領域的研究中，有大量利用自身抗體創制出治療性抗體的成功經驗[16,17]。從機制上說，在正常生理條件下，自身抗體作為固有免疫的產物，起到維持體內生理平衡、清除循環系統中的異常蛋白和死亡細胞及保護機體的作用[21,22]。但是在病理條件下，自身抗體的產生很可能是源于體內的異常蛋白，并且具有清除異常蛋白的生理功能。而且，本文也通過技術手段，證明了通過分離培養外周血B細胞獲得的α-syn自身抗體是具有一定生物學功能的。總體來說，自身抗體作為創制α-syn治療抗體的新途徑，較其他途徑有著獨特的優勢。首先，自身抗體靶向體內α-syn異常蛋白，對正常α-syn蛋白不結合或較弱結合，不會影響正常α-syn蛋白的生理功能。其次，對于α-syn蛋白來說，蛋白的缺失只造成了α-syn基因敲除小鼠黑質紋狀體多巴胺途徑的微弱障礙，并沒有影響到基因敲除小鼠的其他生理功能[23]。由此推測，α-syn抗體的應用不會造成對正常神經組織的副作用。綜上所述，來源于自身抗體的PD治療抗體相對于目前市面上治療PD的藥物來說，將具有更高的靶向性和安全性，是研究治療PD疾病藥物的新方向。