養肝澳平對大鼠肝纖維化的防護作用及機制探討*

陳沁磊 邵 銘△ 何 晶 胡謙鋒

1.南京中醫藥大學附屬醫院江蘇省中醫院感染科 (江蘇 南京， 210001) 2.南京中醫藥大學

肝纖維化指的是由于各種致病因素導致肝臟結締組織增生異常，以致肝臟內彌漫性細胞外基質(ECM)過度沉淀的病理過程。現在普遍認為肝星狀細胞的活化是肝纖維化的中心環節。若未得到及時干預則會進入到肝硬化的階段。本文對養肝澳平合劑抗肝纖維化的效果以及作用機制進行深入研究。使用四氯化碳/橄欖油誘導大鼠肝纖維化模型，監測大鼠血清生化指標、肝組織含量及肝臟病理改變，對養肝澳平合劑治療肝纖維化的作用進行綜合評估，探討肝纖維化與細胞轉化生長因子(TGF)-β1、基質金屬蛋白酶(TIMP)-1之間的表達關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 動物：SD大鼠84只，雌雄各半，清潔級，體質量(180±20)g。由江蘇省中醫院實驗室提供。動物合格證號：SCXK-(蘇)2012-0004，揚州大學比較醫學中心。

藥物：養肝澳平合劑：由茵陳、當歸、丹皮、茜草、鳳尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹參、土茯苓等組成，江蘇省中醫院制劑室提供，批號：Z04000376。扶正化瘀膠囊：由丹參、發酵蟲草菌粉、桃仁、松花粉、絞股藍、五味子組成，上海黃海制藥有限責任公司，批號：Z20020074。秋水仙堿片：云南昊邦制藥有限公司，批號：H53021798。

試劑：四氯化碳分析純：南京化學試劑有限公司，批號：13052910772 。使用時用橄欖油配合成40%的油溶液。甲醛溶液：南京化學試劑有限公司，批號：12042410659；(TGF)-β1、TIMP-1抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：20100328。即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒：福州邁新生物公司提供，批號：KIT-5030總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒、丙二醛(MDA)測試盒、羥脯氨酸(HyP)測試盒，購自南京建成生物工程研究所。考馬斯亮蘭蛋白定量測試盒，購自南京建成生物工程研究所。

儀器：TDL-80-2B低速離心儀：上海安亭科學儀器廠；HH-2數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；MODEL DS-671電子秤：上海寺岡電子有限公司；756PC紫外線分光光度計：上海光譜儀器有限公司； RM2135型石蠟切片機：德國LEICA公司產品； Tissue-Tek TEL 組織包埋中心：日本SAKURA公司產品；DM-2000光學顯微鏡：德國LEICA公司產品。

1.2 造模分組及給藥方法 84只清潔級SD大鼠隨機分為7組，即正常組10只，模型組14只，養肝澳平高、中、低劑量組各12只，扶正化瘀及秋水仙堿組各12只。SD大鼠肝纖維化造模采用40%的四氯化碳/橄欖油腹腔注射，劑量為1 ml/kg，每周2次，共4周。造模1周后給藥。正常組與模型組用蒸餾水按20 ml/kg的量進行灌胃；其中養肝澳平高、中、低劑量組給藥濃度分別為28、14、7 g/kg，扶正化瘀組給藥濃度劑量為0.9 g/kg，秋水仙堿組劑量為1.0 mg/kg，每天按20 ml/kg的藥量灌胃給藥1次，共給藥8周。所有大鼠每周稱重1次，根據體質量變化情況調整給藥劑量。

1.3 指標檢測

1.3.1 病理學指標檢測 采用HE染色和Masson染色法。參照1995年慢性肝炎肝纖維化分級分期標準。

1.3.2 血清生化指標 血清分離后直接用全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、谷氨酰轉化酶(GGT)、總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)含量，由江蘇省中醫院檢驗科協助完成。

1.3.3 肝組織T-SOD、MDA、HyP含量測定 先采用考馬斯亮藍法計算出待測樣本蛋白濃度，再按公式計算出肝組織T-SOD、MDA含量。

1.3.4 TGF-β1、TIMP-1含量的檢測 采用快速免疫組化方法。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件分析。計量資料用表示，組間差異用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗，統計前均對各組數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠生存情況 整個實驗過程中，共死亡12只大鼠，其中正常組1只，模型組6只，高劑量組1只，低劑量組1只，扶正化瘀組1只，秋水仙堿組2只。

2.2 各組肝臟病理變化情況 HE染色發現模型組可見肝小葉結構破壞并重新排列，小葉內及小葉間有明顯的炎癥、壞死，肝細胞變性壞死，肝索排列不規則，伴有明顯的纖維組織增生。各治療組肝損傷均有不同程度的減輕，養肝澳平高劑量組僅有輕度炎性浸潤及脂肪變性，肝細胞水腫不明顯，無明顯的纖維組織增生。秋水仙堿組及扶正化瘀組亦有肝纖維組織增生減少、纖維間隔變窄及炎癥減輕等，但肝纖維化程度以養肝澳平組最優。見彩插頁圖1。Masson染色顯示模型組表現為小葉結構破壞，膠原纖維彌漫性增生，并形成條索狀像周圍布散，形成纖維間隔。治療組均有不同程度的肝纖維化，但較模型組有明顯減輕。養肝澳平高劑量組最優，僅有少量呈淡藍色的膠原纖維，無明顯肝小葉破壞及纖維間隔；秋水仙堿組次之，匯管區周圍可見有少量纖維組織沉積，其余組肝纖維化無明顯差異。見彩插頁圖2。各組大鼠肝纖維化分級評分見表1。

表1 各組大鼠肝纖維化分級評分 (只)

2.2 各組大鼠血清生化指標的比較 見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標比較

與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各組大鼠肝組織T-SOD、MDA、HyP含量的比較 見表3。

表3 各組大鼠肝組織T-SOD、MDA、HyP含量

與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-1表達 模型組TGF-β1表達明顯增加，匯管區、纖維間隔可見大量加深的陽性染色。其余各組可見TGF-β1不同程度減少，養肝澳平高劑量組尤顯，僅在匯管區可見少量陽性染色。TIMP-1在模型組陽性表達范圍較廣，尤其是纖維間隔、匯管區、竇周細胞，棕黃色著色。養肝澳平高、中劑量組及秋水仙堿組TIMP-1沉積明顯減輕，陽性細胞數目顯著減少。各組大鼠肝組織TGF-β、TIMP-1的平均光密度值，見表4。

表4 各組大鼠肝組織TGF-β1、TIMP-1平均光密度值比較

與正常組比較，△P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

肝纖維化是慢性肝病發展成為肝硬化的共同病理基礎，其中肝星狀細胞的活化是中心環節。因此對肝纖維化的治療及機制探討極為重要。

SOD、MDA為脂質過氧化物指標，SOD主要反映氧自由基的清除能力，有“高效的清道夫”之稱[1]。MDA則能反映肝細胞膜脂質過氧化的強弱,能反映肝臟損傷的程度[2]。二者配合測定從而更準確地反映肝纖維化的程度。HyP是膠原纖維組織中特有的非必須氨基酸，間接反映肝臟膠原蛋白的含量，直接反映肝纖維化的程度。TGF-β1是目前被認為最強的肝纖維化致病因子，不僅能通過“旁分泌”的形式多途徑促進肝星狀細胞(HSC)的活化,加速膠原纖維的合成及ECM的沉積；還能阻止MMPs的合成、促進TIMPs生成，從而抑制ECM的降解[3]。TIMPs是抑制MMPS活性的一組糖蛋白，在肝臟組織中僅發現TIMP-l和TIMP-2，其中TIMP-1的抑制作用最強。HSC激活增殖后，TIMP-1不斷升高，特異性與MMP-1相結合，從而抑制MMP-1活性，減少Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM的降解，加速ECM的沉積及肝纖維化進程[4]。

目前中醫藥治療肝纖維化主要采取扶正化瘀法，而針對清熱解毒化濕法研究較少。養肝澳平合劑是江蘇省中醫院內制劑，是俞榮青主任的經驗方，該方由茵陳、當歸、丹皮、茜草、鳳尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹參、土茯苓等組成，具有活血涼血、清熱利濕解毒的功效，本方最初是在治療慢性乙型肝炎的研究成果的基礎上提出的，但對于濕熱疫毒內存、血瘀于肝的肝纖維化尤為適宜。俞榮青等[5]通過用養肝澳平合劑治療，觀察慢乙肝患者的短期、長期療效及血清乙肝病毒標志物變化，結果表明經養肝澳平治療，血清HBV標志物轉陰率增高，感染鴨血中DHBV-DNA可被抑制，肝細胞損傷減輕，肝纖維化減少。車軍勇等[6]用養肝澳平合劑治療肝纖維化患者，與對照組相比，發現治療組患者肝功能及肝纖維化指標明顯好轉。姚志剛等[7]納入濕熱血瘀證型的乙型肝炎肝纖維化患者40例，服用養肝澳平治療，并與扶正化瘀膠囊做陽性對照，發現養肝澳平合劑能明顯改善患者肝功能與肝纖維化水平，升高A/G比值，并能顯著改治療患者的癥狀和體征。

通過本次實驗研究，我們可以推測，在肝纖維化的發生發展中，養肝澳平合劑能通過減少TGF-β1的分泌，抑制HSC的活化增殖；抑制TIMP-1的表達，增加MMP-1的活性，促進Ⅰ、Ⅲ型膠原等ECM的降解，從而改善肝纖維化的進程。