中醫藥調控干細胞移植治療肝硬化的研究進展＊

呂艷杭，吳姍姍，王振常，溫智稀，葉學勁

（1. 廣西中醫藥大學研究生學院 南寧 530222；2. 廣西中醫藥大學國際壯醫醫院 南寧 530201）

肝硬化是由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損傷，是各種慢性肝病的終末期。我國目前感染乙型肝炎病毒的患者約有7300萬人，同時隨著社會生活水平的提高，大量飲酒、肥胖及糖尿病等發病率的增高引起酒精性和非酒精性脂肪肝增多，這些患者都有可能或已經發展成為肝硬化[1-2]。據此推斷，肝硬化患者的群體十分龐大，而對于肝硬化有效的治療，是目前醫學界治療肝硬化尚未攻克的一道難題。目前除了原位肝移植尚沒有特效的治療方法，但肝臟供體的缺乏、術后高免疫排斥反應及高醫療費用等因素限制了其在臨床上的廣泛應用，因此尋求有效的治療措施是當前亟待解決的關鍵問題。

干細胞的移植為肝硬化患者帶來了希望。干細胞是一類具有高度分化潛能及自我更新能力極強的細胞[3-4]。目前治療肝硬化的干細胞有骨髓間充質干細胞、脂肪間充質干細胞、胚胎干細胞及臍帶血細胞。大量研究證實了[5-6]來源不同的干細胞移植，對肝硬化引發的肝組織損傷的治療均有明顯的作用。干細胞移植是繼傳統原位肝移植（Orthotopic Liver Transplantation OLT）后一種新型的治療肝硬化的治療方法，該方法打破了肝硬化患者肝細胞損傷不可逆轉的理念。中醫藥可以提高干細胞移植的存活及增殖能力，誘導其向肝細胞定向分化，改善移植后的肝臟的病理微環境等參與干細胞移植治療肝硬化[7]，從而展現中醫藥獨特的價值。本文通過闡述中醫藥調控干細胞治療肝硬化已有的研究成果及中藥復方或中藥單體協同干細胞移植治療肝硬化存在的機制，為中醫藥干預干細胞移植治療肝硬化提供理論基礎。

1 干細胞移植對肝硬化的影響

1.1 干細胞誘導轉分化為肝樣細胞

在特定的環境下，骨髓間充質干細胞、造血干細胞及臍帶血細胞可以被誘導轉分化為肝樣細胞。雷香麗等[8]把綠色熒光（GFP）轉基因SPF 級雄性大鼠間充質干細胞移植入肝硬化大鼠，移植3 周后行大鼠肝臟冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察在肝臟內分布的GFP 細胞，采用石蠟切片行GFP 抗體及白蛋白抗體免疫組化雙標法檢測GFP 陽性細胞在大鼠肝臟內的分布，結果發現移植3 周后的大鼠肝內可見GFP 陽性細胞及ALB 陽性細胞。邢全臺[9]與王忠瓊等[10]骨髓間充質干細胞用HGF、EGF 等誘導分化為肝樣細胞，表明大鼠骨髓間充質干細胞在細胞因子的誘導下可轉分化為肝樣細胞，對大鼠肝損害具有修復作用。王豪勛等[11]將分離純化的間充質干細胞與四氯化碳（CCl4）誘導的大鼠肝硬化組織中以Transwell 共同培養，結果顯示在受損的肝組織環境中，間充質干細胞可以分化為肝樣細胞。Guo 等[12]體外細胞實驗利用集落細胞刺激因子和肝細胞生長因子成功誘導大鼠骨髓間充質干細胞轉分化為肝樣細胞。李夢等[13]將肝癌細胞HepG2與骨髓間充質干細胞（BMSCs）共同培養后發現HepG2對BMSCs 具有顯著的趨化、增殖與分化作用，使用過表達肝癌高表達轉錄本后可促進BMSCs 轉分化為肝樣細胞，表明攜帶具有抑癌基因或細胞毒性藥物的BMSCs 可以向肝臟癌變部位遷移，有利于提高肝癌治療的特異性，同時可有效地減少治療（放、化療）全身毒副作用。

1.2 干細胞促進肝星狀細胞凋亡

肝纖維化是有各種損傷因素所致的肝臟內結締組織異常增生的病理過程，是所有慢性肝病的共同病理階段，是肝硬化的必經階段。參與肝纖維化的細胞包括肝星狀細胞、中性粒細胞、肝竇內皮細胞等。而肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）是致肝纖維化的最效應細胞，其增殖與活化是肝纖維化發生發展的中心環節。諸多研究者[14-16]發現骨髓間充質干細胞移植入肝硬化的大鼠體內后，BMSCs 能夠在肝臟內定植，發揮減輕肝臟的炎癥反應及改善肝功能和肝纖維化的程度。骨髓間充質干細胞能分泌肝細胞生長因子、表皮細胞生長因子，白細胞介素、轉化生長因子等多種細胞因子，其中肝細胞生長因子具有促進肝星狀細胞凋亡的作用，不僅僅其具有誘導骨髓間充質干細胞向肝樣細胞分化的功能，還可以抑制轉化生長因子-β（TGF-β）的產生，達到抑制肝星狀細胞活化后的細胞外基質過度沉積，從而促進肝星狀細胞發生凋亡[17-18]；白細胞介素-10（IL-10）能阻斷腫瘤壞死因子（TNF-α）的纖維化的信號通路，從而減少纖維化進程。姚志成等[19]發行培養骨髓間充質干細胞的上清液可有效的下調肝星狀細胞中的轉化生長因子（TGFβ）、金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）、膠原蛋白I（COLα1）的表達，促進肝星狀細胞的凋亡，抑制肝纖維化的發生發展進程。

2 干細胞移植治療肝硬化的實驗研究

2.1 基礎實驗研究

大量研究證實[20-22]肝臟受損時會誘導SDF-1 的表達上調，不僅可以促進炎性細胞向損傷的肝臟聚集，還可以促進表達CXCR4 的干細胞發生遷移，高表達SDF-1 的微環境對干細胞在受損肝臟中的存活及修復發揮著至關重要的作用。王華偉等[23]研究顯示補腎化瘀生新方促進干細胞歸巢、增加干細胞數量，達到延緩衰老的目的。Shao 等[24]研究表明，肝硬化后出現SDF-1 表達上調，干細胞移植到體內后SDF-1 表達進一步上調，與脾臟和骨髓相比較，大部分的干細胞進入受損的肝組織中，進一步說明SDF-1/CXCR4在干細胞歸巢到受損的肝臟發揮修復作用。Mohamed 等[25]認為BMSCs 移植膽汁淤積性肝纖維化大鼠模型，結果顯示肝細胞的HCF 和MMP-2 mRNA 升高，CK-19 mRNA HGF 在MSCs 分泌的細胞中表達減少，從而纖維化大鼠肝臟中的BMSCs 表達明顯增多，表明細胞因子聯合骨髓干細胞可促進干細胞轉化為肝樣細胞。趙家峰等[26]研究發現采用CXCR4 拮抗劑和CXCR4 受體能明顯抑制羊水干細胞遷移到大鼠肝臟中，進一步說明SDF-1/CXCR4 介導的信號通路發揮著至關重要的作用。王志紅等[27]體外研究證實通過轉染使得過表達CXCR4 的干細胞更具有向SDF-1 的遷移能力。馬虎成等[28]研究發現轉染CXCR4 基因能促進干細胞在肝臟的定植，改善肝功能，進一步表明干細胞向損傷的組織遷移與干細胞表面表達的CXCR4 的數量成正比。黃曉明等[29]研究表明在受損肝組織中SDF-1主要分布在CXCR4表達的肝卵圓細胞上，更進一步說明了在受損肝組織的修復過程中，通過SDF-1 濃度梯度變化對CXCR4 的吸引，同時SDF-1/CXCR4 軸可能是刺激肝干細胞的激活，從而促進肝卵圓細胞的增殖，以此完成對肝臟受損部位的修復。目前，肝卵圓細胞是公認的專能肝干細胞，在肝臟微環境的調控下，其可以分化為肝細胞。當肝臟發生肝纖維化甚至肝硬化時，大量肝細胞生長受阻甚至死亡，而肝卵圓細胞出現在肝小葉周圍，使其能夠促進SDF-1、CXCR4 高表達。

2.2 國內外的臨床研究

溫智稀[30]研究表明，柔肝化纖顆粒聯合干細胞移植可改善肝功能及延緩肝纖維化的進展，達到協同治療肝硬化的作用。李勁等[31]選取丙肝代償期和失代償期肝硬化患者60例，研究結果顯示肝硬化患者外周血中的SDF-1與CXCR4表達量上調，且兩者水平呈正相關，提示了SDF-1與CXCR4參與調控肝硬化的發生發展。Jang 等[32-33]采用自體骨髓間質干細胞輸注治療肝硬化失代償期，結果顯示肝纖維化指標下降、CP 級下降、肝再生（肝體積增加）。Liu等[34]采用拉夫米定聯合阿德福韋酯聯合干細胞移植治療乙肝肝炎失代償期肝硬化，實驗組顯示肝功能指標、臨床癥狀明顯改善，結果表明，聯合干細胞分化為正常肝樣細胞，恢復肝臟結構，改善肝功能，提高患者生存質量。鄭盛等[35]研究分別選取肝硬化失代償期患者67 例與48 例，采用抽取自體骨髓間充質干細胞及體外分離方法，于肝動脈行自體骨髓間充質干細胞移植治療，治療組患者經治療后發現AST、ALT、TB 均下降，ALB 上升，食欲不振、腹水、腹脹腹滿等癥狀好轉，術后嚴重并發癥0例，所有患者均無白細胞下降、出血或肝區疼痛等情況，結果表明在經肝固有動脈自體BMSCs 移植治療肝硬化失代償期，能有效改善肝功能、凝血功能及臨床癥狀，是一種安全、有效的治療方法。

目前，對晚期肝硬化患者的的內科治療相對比較保守，且國內外對原位肝移植所需要的肝源是非常緊張，因此闡述中醫藥調控干細胞移植治療肝硬化的具體機制，為干細胞移植治療肝硬化的療效提供理論基礎。

3 中醫藥調控干細胞移植治療肝硬化的機制

3.1 中藥復方調控干細胞移植治療肝硬化機制

劉芳等[36]研究發現茵陳四苓顆粒聯合干細胞移植，能有效減輕肝硬化慢性大鼠肝功能損害，移植肝細胞凋亡，其機制可能與下調肝臟組織Caspase-3 蛋白的表達，調控凋亡基因Bax mRNA、BCL-2 mRNA 表達有關。黃晶晶等[37]通過動物實驗及細胞實驗發現鱉甲煎丸聯合BMSCs 具有延緩CCl4 誘導的大鼠肝纖維化及緩解肝功能損害的作用，采用CXCR4的特異性拮抗劑后，發現聯合組與單純鱉甲煎丸組、干細胞組與模擬組的療效相當，而未使用CXCR4 的特異性拮抗劑，聯合組與單純鱉甲煎丸組、干細胞組與模擬組的療效存現顯著差異，結果表明鱉甲煎丸聯合BMSCs 移植可提高肝纖維化的治療效果，其機制可能與SDF-1/CXCR4 有關。溫智稀等[38]研究表明鱉甲煎丸能促進干細胞分化為肝樣細胞，其作用機制可能與調節干細胞Notch 信號通知中Notch-1 蛋白以及Notch-1 mRNA表達水平有關。張久梅[39]研究表明干細胞移植能夠改善肝硬化大鼠的肝功能、減輕膠原蛋白的沉積及肝纖維化程度，健脾活血方聯合干細胞移植治療肝硬化大鼠能顯著降低大鼠ALT、TBIL 水平及羥脯氨酸含量，增加ALB 的含量，從而減輕膠原蛋白的沉積及改善肝纖維化程度。劉瑩等[40]研究證實濟生腎氣湯聯合干細胞移植可明顯改善肝硬化大鼠的T淋巴細胞亞群和紅細胞免疫功能。現報道表明[41]一貫煎能夠促進BMSCs 募集到肝臟，從而發揮逆轉肝纖維化的作用。左歸丸可通過抑制炎癥發生、改善肝纖維化、激活細胞因子等誘導BMSCs 橫向分化為肝實質細胞[42]。張金生等[43]研究認為活血化瘀方藥不僅能激活并促進內源性干細胞的大量增殖，也可調控干細胞分化方向。溫智稀等[44]研究發現鱉甲煎丸聯合組在誘導14、21、28 天時ALB、CK18 及AFP 陽性細胞率均高于肝細胞生長因子（HGF）加纖維化生長因子（FGF-4）組，說明鱉甲煎丸具有BMSCs 轉分化為肝樣細胞的能力，且效果優于HGF+FGF-4 的誘導分化能力，進一步證實了活血化瘀、軟堅散結具有促進干細胞的轉分化肝細胞。黃進等[45]研究證實了補腎益精的代表方左歸丸含藥血清可促進干細胞的增殖，可能與促進細胞SCF mRNA 及可溶性SCF 蛋白表達有關。李連達院士等[46]研究發現歸元方與干細胞移植對急慢性肝損傷有明確的治療作用，兩者合用優勢互補，協同增效。劉江凱[47]研究發現百令膠囊聯合干細胞移植可有效治療肝纖維化及早期肝硬化，保護肝細胞以及改善肝功能及肝纖維化指標。

3.2 中藥單體調控干細胞移植治療肝硬化機制

崔運浩[48]研究證實黃芪甲苷、毛蕊異黃酮兩藥配伍能有效激活JAK2/STAT5 信號轉導通路，上調小鼠骨髓干細胞的珠蛋白基因調控網絡因子的KLF1 mRNA、BCL1 mRNA，促進GATA1 蛋白的表達。張繼紅等[49]在干細胞培養液中加入肝細胞生長因子（HGF）+ GS（珠子參皂苷）誘導分化21 天后，實驗組的干細胞貼壁集落樣增殖，形態分化為肝樣細胞，表達肝細胞特有的ALB、AFP 及CK18，采用RT-PCR 及Western Blot 顯示ALB、AFP 及CK18 mRNA 及蛋白的表達，糖原染色可在熒光顯微鏡下看見有油紅色的顆粒，表明經過聯合培養的細胞有肝細胞特有的合成糖原的功能，為后續于體內進行BMSCs 聯合珠子參皂苷治療終末期肝病。沈自尹等[50]提出“腎所藏之精可相應于胚胎干細胞以及其他分化為各種組織器官的成體干細胞，干細胞具有先天之精的屬性”的新學術觀點，并證實了補腎中藥淫羊藿可通過動員與提高激素、細胞因子水平激活內源性干細胞，發揮機體儲備的潛力而治療疾病。楊諭晨[51]研究表明蟲草多糖聯合間充質干細胞治療肝硬化具有協同、增效作用，可促進膠原蛋白的降解、減少膠原沉積，緩解甚至逆轉肝纖維化。歐陽競峰[52]等研究證實了紅景苷天聯合干細胞移植可協同治療肝硬化，既可促進干細胞的存活、增殖和分化能力，又可明顯改善肝功能，逆轉肝纖維化，其具體機制可能與干細胞的轉分化能力及分泌的生長因子相關。

4 討論

目前國內外關于中醫藥調控干細胞移植的研究報道已有眾多，本文通過搜索國內外數據庫，如知網、萬方、維普、Pubmed等數據庫，系統闡述干細胞移植對肝硬化的影響、中醫藥調控干細胞移植治療肝硬化的實驗研究及中醫藥調控干細胞治療肝硬化機制等三個方面著手，是該文的創新點。其在一定程度上可揭露中醫藥聯合干細胞移植治療肝硬化的作用機制，研究證實相對成熟的機制有SDF/CXCR4 信號通路,表明SDF-1濃度梯度變化對CXCR4具有吸引作用，同時干細胞可沿SDF-1/CXCR4軸向肝臟歸巢，且還可能促進肝干細胞的激活，從而促進肝卵圓細胞的增殖，以此完成對肝臟受損部位的修復，其機制還包括JAK2/STAT5、BCL/Bax、Notch信號通路等。但是國外關于藥物研究的機制已經漸漸步入細胞自噬、外泌體及非編碼RNA 等方面深入藥物分子機制的研究，然而目前我國的諸多研究，研究質量較低、研究層面表淺，實驗的可重復性比較差，且后期無進一步深入探討，這將不利于祖國傳統瑰寶中醫藥機制的闡明及中醫藥靶向分子的深入挖掘。因此今后我們要更加規范的將基礎研究與臨床研究緊密結合，從而提高中醫藥調控干細胞移植在治療肝硬化的應用效果。