骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠受損腸黏膜修復(fù)作用的探究

羅文捷，張啟芳，孟云超，趙 磊，唐澄海，張 晶，王柏濤，唐光耀

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)病程遷延、難以治愈，眾多學(xué)者認(rèn)為腸道持續(xù)反復(fù)感染、腸黏膜屏障功能障礙、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)失衡、遺傳和環(huán)境等多種因素共同參與了疾病的發(fā)生發(fā)展[1-3]。在UC的模型中，腸道呈高通透性、黏膜組織損傷和破壞，導(dǎo)致腸腔內(nèi)的細(xì)菌、毒素及食物抗原等直接侵入黏膜的免疫系統(tǒng)引起炎癥反應(yīng)。因此，修復(fù)受損腸黏膜、維持腸黏膜的正常屏障功能在UC的治療中尤其關(guān)鍵[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潛能，能幫助組織和細(xì)胞修復(fù)、增殖，并能通過誘導(dǎo)和刺激內(nèi)源性祖細(xì)胞來改善腸黏膜損傷，降低腸道通透性及絨毛破壞，調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，從而促進(jìn)黏膜屏障功能的恢復(fù)[5-7]。研究[8]表明，BMSCs能通過促進(jìn)炎癥所致?lián)p傷組織的再生及修復(fù)起到治療作用，Chen et al[6]也證實(shí)了注射的BMSCs會(huì)定植到受損結(jié)腸,并促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和腸干細(xì)胞分化；但BMSCs對(duì)UC治療的具體機(jī)制仍有待明確。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料SPF級(jí)3周齡BALB/C雄性小鼠4只，購(gòu)自上海斯萊克公司，清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度(20±4)℃，濕度45%～60%，通風(fēng)良好，光照隨晝夜浮動(dòng)，頸離斷處死后，在無菌條件下分離股骨并分離提取BMSCs，進(jìn)行傳代培養(yǎng)以備實(shí)驗(yàn)使用；SPF級(jí)6～7周齡BALB/C雌性小鼠75只，體質(zhì)量19～21 g，購(gòu)買公司及飼養(yǎng)條件同上；CD29、CD45、CD90抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)購(gòu)自上海翊圣生物有限公司；兔抗間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor, c-Met)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatoc yte growth factor，HGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活因子(hepatocyte growth factor activator，HGFA)ELISA試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；成骨誘導(dǎo)試劑盒(Von Kossa Kit)購(gòu)自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1BMSCs的培養(yǎng)分離與鑒定 3周齡大小 BALB/C 雄性小鼠，頸離斷處死，無菌條件下分離股骨，用5 ml注射器抽吸低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)輕輕沖出骨髓直至髓腔變白，將沖洗液移入10 ml的無菌離心管中，混勻、離心、棄去上清液，然后用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的L-DMEM重懸細(xì)胞，并接種于無菌塑料培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；于24 h細(xì)胞貼壁后首次更換培養(yǎng)液，往后每2～3 d更換培養(yǎng)液1次；待細(xì)胞生長(zhǎng)至約瓶底體積80%時(shí)，用含0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，并按1 ∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。利用BMSCs與其他細(xì)胞的貼壁差異性嚴(yán)格控制傳代時(shí)胰酶的量和消化時(shí)間，取形態(tài)均一、活性良好的第 3～4 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)2006年制定的多功能間充質(zhì)干細(xì)胞的基本定義對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原 CD29、CD45、CD90的表達(dá)情況；將BMSCs用抗壞血酸/β-甘油磷酸鈉分化培養(yǎng)，3周后Von kossa Kit檢測(cè)成骨情況，油紅O檢測(cè)地塞米松誘導(dǎo)的成脂情況；驗(yàn)證干細(xì)胞多向分化潛能。

1.2.2實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型建立 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(DSS+PBS組)、實(shí)驗(yàn)組(DSS+BMSCs組)，每組25只，正常對(duì)照組正常飲水，其余2組每天飲用4%的DSS(分子量 36 000～50 000)水溶液，共3周，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、BMSCs進(jìn)行干預(yù)治療。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠的一般情況，每天定時(shí)稱體質(zhì)量1次，記錄排便情況，進(jìn)行大便潛血檢查，根據(jù)小鼠疾病活動(dòng)度指數(shù)(disease activity idex，DAI)評(píng)分，評(píng)估疾病的變化。

1.2.3標(biāo)本收集與處理 造模后第8天，實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)尾靜脈注0.3 ml的BMSCs懸液(含1×106細(xì)胞)，其余兩組則注射不含BMSCs的PBS 0.3 ml作為對(duì)照。分別于移植治療后第2、5、9、12、16 天脫頸處死各組5只小鼠，取距離肛門8 cm處的2 cm長(zhǎng)標(biāo)本，12%中性甲醛固定，部分大腸標(biāo)本-80 ℃保存。固定后的結(jié)腸標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作5 μm厚連續(xù)切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察全部切片組織病理學(xué)改變，并從炎癥程度、炎癥范圍、隱窩損傷及損傷范圍4個(gè)方面對(duì)結(jié)腸的炎癥活動(dòng)情況進(jìn)行評(píng)分。免疫組化染色鏡下觀察c-Met、EGFR、PCNA的表達(dá)水平，一抗稀釋濃度依次為1 ∶150、1 ∶100、1 ∶500。按ELISA試劑盒操作步驟完成結(jié)腸組織勻漿中HGF、HGFA的檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的鑒定鏡下觀察BMSCs貼壁生長(zhǎng)，呈梭形、漩渦狀，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面抗原CD29、CD45、CD90的表達(dá)情況，結(jié)果為CD29(+)，CD45(-)，CD90(+)，并成功誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，說明BMSCs的分離提取成功。見圖1。

圖1 BMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定

A：BMSCs的光鏡下表現(xiàn) ×100；B、C：流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原；D：BMSCs成骨誘導(dǎo) ×200；E：BMSCs成脂誘導(dǎo) ×200

表1 小鼠DAI評(píng)分

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：#P<0.05

表2 小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)分

與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：#P<0.05

2.2 小鼠的一般情況及DAI評(píng)分在正常對(duì)照組中，小鼠皮毛有光澤、順滑，反應(yīng)靈敏，活動(dòng)度好，無體質(zhì)量減輕，糞便成正常條形；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠毛色混雜、缺少光澤，反應(yīng)遲滯，活動(dòng)度明顯減低，出現(xiàn)拱背、扎堆等表現(xiàn)，體質(zhì)量下降，糞便稀糊狀、水樣，給藥第5天開始有大便帶血或血便，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，體質(zhì)量下降及血便情況更加明顯；實(shí)驗(yàn)組小鼠毛色不如正常對(duì)照組有光澤，略顯混雜，小鼠活動(dòng)度基本正常，部分小鼠出現(xiàn)輕度體質(zhì)量減輕或便中帶血表現(xiàn)，但均不如實(shí)驗(yàn)對(duì)照組嚴(yán)重。

BMSCs干預(yù)治療和治療天數(shù)的交互作用對(duì)小鼠DAI評(píng)分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.588，P=0.023)。BMSCs注射后第2、5天，實(shí)驗(yàn)組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠DAI評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠DAI評(píng)分高于實(shí)驗(yàn)組(P>0.05)；BMSCs注射后第9、12天，實(shí)驗(yàn)組小鼠DAI評(píng)分均明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.0，P=0.011；F=23.143，P=0.009)。在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)于不同時(shí)間點(diǎn)，小鼠DAI評(píng)分間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.426、0.368。干預(yù)后第16天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組部分小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重血便、甚至死亡，故未進(jìn)行評(píng)分比較。見表1。

2.3 小鼠腸上皮組織學(xué)變化在正常對(duì)照組中，小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞染色均勻，排列整齊，無明顯黏膜層、黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞表現(xiàn)，腺體排列規(guī)則，隱窩形態(tài)正常，未見炎性浸潤(rùn)；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)破壞明顯，腺體及隱窩結(jié)構(gòu)隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸破壞，于實(shí)驗(yàn)后期可出現(xiàn)上皮嚴(yán)重壞死、缺損、斷裂表現(xiàn)，甚至失去正常腺體、隱窩結(jié)構(gòu)，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜固有層及黏膜下層，嚴(yán)重者可累及全層；實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)尚規(guī)整，無明顯斷裂、缺損表現(xiàn)，黏膜固有層腺體、隱窩結(jié)構(gòu)基本正常，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜固有層，但未及黏膜下層，炎癥細(xì)胞數(shù)量及浸潤(rùn)深度均不及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。

BMSCs干預(yù)治療和治療天數(shù)的交互作用對(duì)小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)分的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.711，P<0.001)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分?jǐn)?shù)均明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，BMSCs干預(yù)后第2、5天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但BMSCs干預(yù)后第9、12天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜組織明顯破壞，組織學(xué)評(píng)分顯著高于實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.0，P=0.004；F=240.286，P<0.001)。在實(shí)驗(yàn)組中，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.108；而在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中，不同時(shí)間點(diǎn)小鼠結(jié)腸黏膜組織學(xué)評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.468，P<0.001)。干預(yù)后第16天，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織幾乎不見正常結(jié)構(gòu)，未進(jìn)行評(píng)分。見表2、圖2。

2.4 c-Met、EGFR、PCNA在小鼠結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)c-Met、EGFR主要表達(dá)于小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中c-Met、EGFR表達(dá)較正常對(duì)照組明顯減少，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，減少趨勢(shì)越明顯，干預(yù)治療后第12天及以后，小鼠結(jié)腸正常黏膜結(jié)構(gòu)明顯破壞，上皮層破損、斷裂，幾乎不見正常腺體、隱窩結(jié)構(gòu)，c-Met、EGFR幾乎不表達(dá)；但BMSCs干預(yù)治療后小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中c-Met、EGFR的表達(dá)與正常對(duì)照組表達(dá)差異不大。PCNA主要表達(dá)于細(xì)胞核，是反映細(xì)胞核增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中PCNA表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組較正常對(duì)照組的表達(dá)略有減少或無明顯差別。見圖3。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理切片 HE×200 A、D、G：分別為第5、9、12天正常對(duì)照組；B、E、H：分別為第5、9、12天實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；C、F、I：分別為第5、9、12天實(shí)驗(yàn)組

圖3 小鼠結(jié)腸黏膜組織c-Met、EGFR、PCNA的表達(dá) ×400 A-C、D-F、G-I分別為第12天小鼠結(jié)腸黏膜組織c-Met、EGFR、PCNA的表達(dá)；A、D、G：正常對(duì)照組；B、E、H：實(shí)驗(yàn)對(duì)照組；C、F、I：實(shí)驗(yàn)組

2.5 結(jié)腸組織HGF、HGFA的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)對(duì)照組HGF的表達(dá)量于干預(yù)后第2天達(dá)峰值，高于其余2組，之后其表達(dá)急劇下降，于第9天達(dá)最低峰，且除第2天外，其表達(dá)量均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；HGF在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)為先下降后上升，并于BMSCs干預(yù)治療第9天下降到最低值，干細(xì)胞注射后第5、12及16天，實(shí)驗(yàn)組HGF表達(dá)量明顯高于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組HGFA的表達(dá)量先下降后上升,第9天達(dá)最低峰，除第5天、第9天，其余時(shí)間點(diǎn)與正常對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而實(shí)驗(yàn)組HGFA的表達(dá)隨給藥時(shí)間基本呈上升趨勢(shì)，第2、5、12天表達(dá)明顯低于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(P<0.05)，與HGF表達(dá)趨勢(shì)不一致。見圖4。

圖4 結(jié)腸組織HGF、HGFA的ELISA結(jié)果

A：小鼠結(jié)腸組織中HGF的表達(dá)情況；B：小鼠結(jié)腸中HGFA的表達(dá)情況；與正常對(duì)照組比較：*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較：#P<0.05

3 討論

UC在全球范圍內(nèi)困擾著上百萬人，但是有效的治療方法仍然缺乏，尋找治療UC的新方法尤為迫切。UC治療困難的主要原因是腸黏膜上皮持續(xù)反復(fù)的損傷或破壞以及黏膜修復(fù)功能障礙[9]，越來越多證據(jù)[10]表明，干細(xì)胞移植是修復(fù)受損腸黏膜的有效手段，事實(shí)上，許多研究[11]表明BMSCs在動(dòng)物模型或臨床試驗(yàn)中對(duì)各種炎性及自身免疫性疾病的治療是有效的，這與該研究得到的結(jié)論一致，并且，已有BMSCs治療臨床病例(如頑固性自身免疫性關(guān)節(jié)炎等)的成功報(bào)道[12]，其安全性、有效性均得到部分證實(shí)。

該研究從小鼠骨髓中分離BMSCs并將其移植到DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中，結(jié)果顯示BMSCs移植能夠改善UC小鼠的疾病狀況，并能減輕UC小鼠模型腸黏膜損傷，促進(jìn)受損黏膜再生，提示BMSCs移植是治療UC的一種有效的方法。同時(shí)，該研究驗(yàn)證了BMSCs對(duì)受損腸黏膜的修復(fù)作用不僅通過動(dòng)員相應(yīng)的成熟細(xì)胞替代受損組織細(xì)胞，還通過進(jìn)入受傷組織的微環(huán)境并刺激生長(zhǎng)因子包括HGF、c-Met及表皮生長(zhǎng)因子[13]等進(jìn)一步促進(jìn)損傷組織細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)損傷組織的修復(fù)[14]。既往報(bào)道[15]顯示BMSCs移植明顯增加了炎癥性腸病模型大鼠小腸損傷黏膜和隱窩層的厚度。該研究PCNA染色也發(fā)現(xiàn)BMSCs移植加速了受損結(jié)腸組織細(xì)胞的增殖；UC小鼠經(jīng)BMSCs治療后，2種經(jīng)典的增殖相關(guān)分子c-Met和EGFR在受損結(jié)腸組織中表達(dá)也明顯上調(diào)；此外，BMSCs移植后生長(zhǎng)因子特別是HGF的表達(dá)水平也被證實(shí)升高。綜上，該研究清楚表明BMSCs移植能夠修復(fù)UC小鼠模型腸黏膜損傷。并且，潛在機(jī)制的研究表明BMSCs移植可促進(jìn)HGF、c-Met、EGFR等細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)分子的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)p傷腸黏膜細(xì)胞增殖，修復(fù)受損組織。

HGF是一種多功能生長(zhǎng)因子，能刺激上皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、侵襲、增殖和形態(tài)形成，在損傷組織中，HGFA生成增多，使激活的HGF表達(dá)增多，從而發(fā)揮促細(xì)胞分化、再生修復(fù)作用。但在該研究中，HGFA的表達(dá)僅在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，與HGF在實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中的表達(dá)趨勢(shì)類似，實(shí)驗(yàn)組中HGFA表達(dá)的改變趨勢(shì)與HGF的改變趨勢(shì)并無明顯關(guān)聯(lián)，且HGFA在3組之間的表達(dá)并沒有明顯的規(guī)律性差異，可能暗示BMSCs的干預(yù)會(huì)影響HGFA的表達(dá)，這還需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。