金黃色葡萄球菌LukS-PV-GFP融合蛋白的載體構建及表達純化

汪自然，常文嬌，戴媛媛，馬筱玲

金黃色葡萄球菌LukS-PV和LukF-PV共同組成殺白細胞素(Panton-Valentine leukocidin,PVL)，二者在分葉核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)上形成聚合體，通過膜穿孔機制引發細胞裂解和凋亡[1-2]。前期研究[3-6]表明，LukS-PV單組分對于白血病細胞具有誘導凋亡和分化的雙重作用，因而LukS-PV有望成為一種新的白血病治療藥物，具有深入研究的價值。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是由Shimomura et al[7]于1962年從多管水母中純化得到的能夠自發出綠色熒光的蛋白，GFP作為一種理想的標簽蛋白，能夠用于蛋白功能定位研究。該研究通過構建LukS-PV基因與GFP基因融合表達載體，并進行表達純化及鑒定，為進一步研究LukS-PV的功能定位和相互作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質粒與菌株 pet28a-N6H-GFP質粒由中國科學技術大學臧建業教授惠贈；大腸桿菌DH5α、BL21、金黃色葡萄球菌銅23均由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 T載體pMD-18T、DNA Taq酶、限制性內切酶BamHⅠ、XhoⅠ，DNA Ligation Kit購于日本takara公司；DNA膠回收試劑盒和快速質粒小提試劑盒購于北京天根公司；蛋白純化試劑盒購于美國Novagen公司；BCA試劑盒購于上海碧云天公司；抗His單克隆抗體和抗GFP單克隆抗體購于美國CST公司；羊抗兔IgG抗體購于武漢abclonal公司。

1.2 方法

1.2.1LukS-PV的基因擴增與基因克隆 煮沸法提取金黃色葡萄球菌銅23的DNA作為PCR模板，具體提取方法見參考文獻[8]。根據LukS-PV序列設計引物，送安徽通用生物技術公司合成。上游5′ -ACGGGATCCGAATCTAAAGCTGATAACAATATTGA G-3′,下游5′-ACCCTCGAGTCAATTATGTCCTTTCAC TTTAATTTC-3′(上下游引物分別引入限制性內切酶BamH I和Xho I酶切位點)。PCR具體的反應條件為：預變性94 ℃、 5 min，變性94 ℃、30 s，退火51 ℃、30 s，延伸72 ℃、45 s，共30個循環，72 ℃延伸8 min。PCR回收產物4 μl、pMD-18T載體1 μl、solutionI 5 μl于4 ℃過夜連接。次日將連接產物使用熱激法(42 ℃、90 s)轉化入DH5α菌中，使用氨芐青霉素篩選單克隆，置于37 ℃溫箱培養過夜，挑取單個菌落，搖菌提質粒，雙酶切后送安徽通用生物技術公司測序。

1.2.2LukS-PV-GFP重組融合質粒的構建與鑒定 測序鑒定正確后，使用限制性核酸內切酶BamH I、Xho I同時對pMD-18T-LukS-PV和pet28a-N6H-GFP質粒37 ℃、2 h進行雙酶切。分別回收pMD-18T-LukS-PV的目的片段和表達載體pet28a-N6H-GFP的載體片段，測定DNA濃度后按目的片段和載體片段5:1于4 ℃連接過夜，次日將連接產物轉化至感受態DH5α菌中，均勻涂布于卡那霉素LB 平板上，置于37 ℃溫箱過夜，挑取單個菌落，搖菌提質粒，進行雙酶切鑒定和DNA測序。最后將鑒定無誤的質粒轉化入大腸桿菌BL21中保存備用。

1.2.3重組融合蛋白的誘導表達與純化 取保存的菌液涂布于卡那平板活化后，挑取單菌落加入LB培養基中，按1 ∶1 000加入卡那霉素，37 ℃過夜培養后轉至100 ml的LB培養基至對數生長期，即A600約為0.6～0.8時，留取一管菌液作誘導前對照，加入IPTG使終濃度達到1 mmol/L，誘導條件為37 ℃、200 r/min，分別在1、2、3、4、5、6 h取樣，使用10%SDS-PAGE電泳分析各時間點的重組融合蛋白表達量。誘導5 h后離心收集細菌，棄去培養基，20 ml PBS重懸細菌沉淀后將重懸菌液超聲破碎，離心后上清液使用His樹脂蛋白純化試劑盒，純化蛋白并測定蛋白濃度。分別取誘導前細菌、誘導5 h細菌、誘導6 h細菌、誘導5 h細菌超聲破碎離心后的上清液、誘導5 h細菌超聲破碎離心后的沉淀、純化后的LukS-PV-GFP蛋白加入上樣緩沖液100 ℃、10 min變性后使用12% SDS-PAGE電泳分析表達量。

1.2.4重組融合蛋白表達宿主的熒光檢測 含有LukS-PV-GFP重組質粒的BL21菌活化后，分別取誘導前和IPTG誘導5 h菌液，取樣涂片，將玻片置于熒光顯微鏡下觀察是否能夠自發熒光。

1.2.5重組融合蛋白的Western blot檢測 分別取誘導前、純化后蛋白樣品，加入上樣緩沖液后100 ℃、10 min變性，使用10%的SDS-PAGE電泳分離后，轉至NC膜，轉膜條件為200 mA、90 min。NC膜經5%脫脂牛奶封閉2 h后，分別與His單克隆抗體(一抗，1 ∶1 000)、GFP單克隆抗體(一抗，1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。次日洗去一抗，加入羊抗兔IgG抗體(二抗)孵育2 h，洗去二抗，加入顯色劑后顯色。

2 結果

2.1 LukS-PV的基因擴增與鑒定分析PCR擴增后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，大約在867 bp處有一條較為明亮的條帶，與預計相符(圖1A)。重組質粒經過BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切后顯示出目的基因片段約867 bp(圖1B)。酶切產物經正反向DNA測序分析，所得序列與NCBI數據庫中序列完全一致。見圖2、3。

2.2 重組蛋白的誘導表達分別取誘導前和誘導1、2、3、4、5、6 h 的蛋白做SDS-PAGE電泳(圖4A)，結果顯示誘導前無重組融合蛋白表達，經過IPTG誘導后在63 ku左右出現明顯的蛋白條帶，大小與預測相符，且5 h時重組融合蛋白表達量最高，可以用于后續蛋白純化。誘導前細菌、誘導5 h細菌、誘導6 h細胞、誘導5 h細菌超聲破碎離心后的上清液、誘導5 h細菌超聲破碎離心后的沉淀、純化后的LukS-PV-GFP蛋白經12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測顯示(圖4B)，超聲破碎后，上清中可見明顯表達條帶，表明其為可溶性表達。純化后蛋白條帶濃厚，雜帶較少，BCA法測定純化后蛋白產物濃度為1.2 mg/ml。

圖1 LukS-PV的PCR擴增與重組質粒的雙酶切鑒定電泳

A： LukS-PV的PCR擴增圖；B: 重組質粒BamH Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切電泳圖；M: DNA Marker；1、2: PCR產物；3: 雙酶切產物

2.3 重組質粒LukS-PV-GFP在大腸桿菌BL21中的表達與檢測含有LukS-PV-GFP質粒的BL21菌，IPTG誘導前無綠色熒光。經IPTG誘導5 h后，取菌液涂片，可以在熒光顯微鏡下觀察到明顯散發綠光的單個細菌(圖5)。取1.5 ml菌液離心，可見綠色菌體沉淀，且純化后的蛋白溶液也為綠色。

圖2 雙酶切產物部分測序圖

圖3 測序結果與Gene Bank中LukS-PV基因序列比對

圖4 LukS-PV-GFP表達產物SDS-PAGE分析

A：LukS-PV-GFP-BL21誘導不同時間點產物SDS-PAGE分析圖；B： LukS-PV-GFP-BL21純化產物SDS-PAGE分析圖；M：蛋白Marker；1：誘導前；2：誘導1 h；3：誘導2 h；4：誘導3 h；5：誘導4 h；6：誘導5 h；7：誘導6 h；8：超聲破碎后上清液；9：超聲破碎后沉淀；10：純化后的LukS-PV-GFP蛋白

圖5 重組質粒在BL21大腸桿菌熒光顯微鏡下圖像 ×100A：誘導前；B：誘導5 h后

2.4 重組融合蛋白的Western blot鑒定Western blot檢測顯示，未加入IPTG誘導時無相應的條帶，經IPTG誘導后純化的重組融合蛋白分別使用抗His單克隆抗體(圖6A)和抗GFP單克隆抗體(圖6B)鑒定，在約63 ku左右位置均出現明顯條帶，與預期相符，表明重組融合蛋白表達成功。

3 討論

LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的PVL中的一個亞單位,課題組前期實驗表明，LukS-PV可誘導人髓系白血病細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、肺癌細胞凋亡，具有抗腫瘤作用，具有深入研究的價值。GFP無需底物、輔助因子的參與即可自發出綠色熒光，易于觀察，且表達的熒光蛋白不會對宿主本身產生毒性[9]。因此，GFP已成為生物化學分子生物學領域的重要標記分子。

圖6 純化重組融合蛋白的Western blot鑒定

A：使用抗His單克隆抗體鑒定；B：使用抗GFP單克隆抗體鑒定；M：蛋白Marker；1：誘導前；2：純化后重組融合蛋白

大腸桿菌系統對許多蛋白耐受能力較強，能高效穩定表達出目的蛋白，已廣泛應用于外源蛋白的表達及純化[10]。外源蛋白在大腸桿菌中表達分為主要存在于上清液中的可溶性表達和主要存在于沉淀中的包涵體表達。高玉錄 等[11]將LukS-PV基因克隆到Rosetta(DE3) plys宿主菌中，SDS-PAGE電泳顯示重組蛋白主要存在于包涵體內，上清液表達較少。常文嬌 等[12]通過去除LukS-PV基因的引導肽，降低了引導肽對蛋白表達的影響，促進了LukS-PV的可溶性表達。本研究以此為基礎，構建了LukS-PV與GFP的重組融合蛋白，電泳顯示重組融合蛋白主要存在于上清液中，無需進行變復性處理，對蛋白的生物學活性影響較小。含有重組質粒的大腸桿菌BL21誘導前無熒光，經IPTG誘導后可以在熒光顯微鏡下自發出綠色熒光，純化后蛋白濃度和純度均較高，表明了融合蛋白在大腸桿菌系統中得到了高效穩定的表達。

使用GFP作為分子標簽是目前研究蛋白質亞定位、動態變化和表達量改變的有效方法[13]。GFP與目的蛋白融合形成熒光標記分子，可以研究目標蛋白的動態變化和與其他蛋白相互作用。本實驗構建LukS-PV基因與GFP基因融合表達載體后導入大腸桿菌中表達并進行純化，實現了對LukS-PV精確定位和動態觀察，為進一步研究LukS-PV的功能定位和相互作用奠定了基礎。