慢性不可預知應激所致抑郁小鼠中縫背核腦區BDNF表達的變化

孟凡濤，劉 晶，王文濤，代娟娟，游晶晶，胡鳳愛，李 晨

抑郁癥又稱抑郁障礙，是一種普遍存在的、嚴重的、并且容易復發的精神疾病，以顯著而持久的心境低落和快感缺失為主要特征[1]。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一種重要的神經營養因子，其基因存在多種剪切體，并且每個剪切體都有特定的啟動子調控[2]。研究[3-5]報道前額葉皮層和海馬的BDNF在抑郁癥發病、圍產期應激或青少年應激誘導成年后抑郁行為以及抗抑郁治療中起著重要作用。此外，研究報道中縫背核5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)神經元廣泛地投射到海馬和前額葉皮層腦區[6]；中樞神經系統中5-HT功能降低、釋放減少及突觸間隙含量下降與抑郁癥的發生密切相關[7-8]。但是中縫背核腦區BDNF在抑郁癥發病中的作用尚未報道。該研究利用慢性不可預知應激(chronic unpredictable stress，CUS)小鼠抑郁模型，結合實時熒光定量PCR(Q-PCR)和Western blot檢測中縫背核腦區BDNF的變化情況，為研究抑郁癥的發病機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 20只雄性SPF級C57BL/6小鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司(生產許可證號：SCXK(魯)20140007)，自由飲水和飲食，環境溫度19～22 ℃，相對濕度40%～60%。本研究中動物實驗均經本單位動物倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑和儀器 總RNA提取試劑盒(美國Omega公司)；RNA反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；RIPA裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)；兔抗BDNF單克隆抗體，鼠抗5-HT多克隆抗體(英國Abcam公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Cell signaling公司)；羊抗兔二抗IR Dye800CW，驢抗鼠二抗IR Dye680LT，雙紅外激光成像系統Odyssey Sa(美國Li-COR公司)；ALexa fluor 488驢抗鼠熒光二抗、ALexa fluor546驢抗兔熒光二抗(美國Thermo Fisher公司)。共聚焦顯微鏡購自日本東京奧林巴斯有限公司(FV1200)、Real-time PCR儀(StepOnePlus)(美國麻省ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1CUS抑郁模型的建立 20只小鼠按隨機數字表法分成對照組與模型組，每組各10只。第1天束縛2 h，第2天24 h光照，第3天電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)，第4天夾尾15 min，第5天高臺30 min，第6天24 h濕盒并傾斜45°，第7天冷水游泳(8 ℃)，第8天束縛2 h，第9天24 h光照，第10天電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)，第11天夾尾15 min，第12天高臺30 min，第13天24 h濕盒并傾斜45°，第14天冷水游泳(8 ℃)，第15天束縛2 h，第16天24 h光照，第17天電擊10 min(0.3 mA電擊2 s，間歇16 s，共10 min)，第18天夾尾15 min，第19天高臺30 min，第20天24 h濕盒并傾斜45°，第21天冷水游泳(8 ℃)，抑郁模型組小鼠單籠飼養，應激結束后經抑郁樣行為試驗評判模型是否成功的指標。

1.2.2糖水偏好試驗(sucrose preference，SPT) 慢性應激21 d結束后，剝奪飲水5 h，2個相同的水瓶分別放置鼠籠的2側，水瓶內分別裝有1%蔗糖水與飲用水，測定夜間12 h內小鼠的糖和水的消耗量，糖水飲用量占糖和水總飲用量的百分比反映小鼠快感缺乏程度。

1.2.3強迫游泳試驗(forced swimming test，FST) 將小鼠放置于透明樹脂水桶中，水溫24 ℃，強迫游泳6 min，記錄小鼠后4 min內靜止不動的時間，以小鼠在絕望環境中試圖逃脫又無法逃脫的狀態評判小鼠的抑郁程度。

1.2.4RNA提取、cDNA合成及Q-PCR 按照組織總RNA提取試劑盒(美國Omega公司)說明書提取海馬總RNA，然后利用RNA反轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉錄合成cDNA，最后用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒進行Q- PCR檢測相關基因表達水平，20 μl反應體系，具體反應條件：95 ℃、 5 min ，95 ℃、 10 s，60 ℃、 30 s，40個循環，并建立溶解曲線95 ℃、 15 s ，60 ℃、 60 s，95 ℃、 15 s。以Actin作為內參基因。以溶解曲線確定PCR反應的特異性，根據熒光曲線的循環閾值(cycle threshold，CT)，按照ΔΔCT方法計算基因的相對表達量。引物序列如下[9-10]：總 BDNF mRNA：上游引物：5′-GCGCCCATGAAAGAAGTAAA-3′，下游引物：5′-TCGTCAGACCTCTCGAACCT-3’；Exon I：上游引物：5′-CTAGCCACCGGGGTGGTGTAA-3′，下游引物：5′-AGGATGGTCATCACTCTTCTC-3’；Exon II：上游引物：5′-CTAGCCACCGGGGTGGTGTAA-3′，下游引物：5′-AGGATGGTCATCACTCTTCTC-3’；Exon IV：上游引物：5′-CAGAGCAGCTGCCTTGATGTT-3′，下游引物：5′-GCCTTGTCCGTGGACGTTTA-3’; Exon VI:上游引物：5′-CTGGGAGGCTTTGATGAGAC-3′，下游引物：5′-GCCTTCATGCAACCGAAGTA-3’；Actin：上游引物：5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，下游引物：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’。

1.2.5Western blot CUS結束后，小鼠斷頭，并在冰上迅速分離海馬，置液氮中速凍，-80 ℃保存備用。取出海馬用含1% PMSF的RIPA裂解液進行裂解，然后加入5×上樣染料，沸水煮10 min，然后用12% 或15% SDS-PAGE 膠進行分離，并轉到PVDF 膜上，膜用TBST buffer (20 μmmol/L TRIs-HCl, pH 7.4, 150 μmmol/L NaCl, 0.1% Tween-20)配制的5%脫脂奶粉封閉1 h，然后 經過一抗(1 ∶1 000)過夜孵育，加熒光二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h， 經Odyssey Sa雙紅外激光成像系統成像并進行灰度識別分析。

1.2.6免疫熒光 腦片制備 C57BL/6小鼠，4%水合氯醛深度麻醉后，經4%多聚甲醛固定后，取腦組織，經30%蔗糖水脫水后進行冰凍切片，厚度40 μm。免疫熒光染色：取中縫背核腦區的腦片經封閉液封閉后，加入一抗混合液(兔抗BDNF 1 ∶200，鼠抗5-HT 1 ∶500)4 ℃孵育過夜，加入二抗混合液(ALexa fluor488驢抗鼠二抗1 ∶400，ALexa fluor 546驢抗兔二抗1 ∶400)4 h，封片劑封片，最后用共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統計學處理采用Graphpad Prism 6.0 進行統計分析并制圖。用Shapiro-Wilk檢驗驗證各組的正態分布情況。相關性分析用Pearson’s correlation coefficient 進行檢驗。各組數值以表示，兩組間比較采用T檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CUS模型小鼠抑郁行為表型檢測糖水偏好和強迫游泳試驗結果：小鼠按照試驗設計流程進行21 d CUS，并在第22天進行SPT，第23天進行FPT，第24天分離中縫背核收取組織，見圖1A。結果顯示，與Control比較，CUS組小鼠糖水偏好值明顯降低(t=2.368，P<0.05)，見圖1B。FPT結果顯示CUS組小鼠不動時間明顯高于Control組(t=2.773，P<0.05)，見圖1C。Shapiro-Wilk檢驗各組數據均符合正態分布(P>0.05)。

2.2 中縫背核腦區BDNF和5-HT免疫熒光雙標結果BDNF為紅色熒光，5-HT為綠色熒光，BDNF和5-HT兩種蛋白熒光重疊之后呈現黃色，見圖2，結果表明中縫背核5-HT神經元中有BDNF表達。

A：CUS模型試驗步驟設計圖；B： SPT； C：FST； 與Control組比較：*P<0.05

2.3 CUS組和Control組小鼠中縫背核BDNF mRNA和蛋白表達量BDNF mRNA檢測結果顯示，與Control組比較，CUS組BDNF mRNA表達量明顯降低(t=3.56，P<0.01)，見圖3A。BDNF蛋白Western blot，見圖3B；數據統計分析結果，見圖3C，CUS組BDNF蛋白表達量明顯降低(t=2.713，P<0.05)。Shapiro-Wilk檢驗各組數據均符合正態分布(P>0.05)。

2.4 CUS所致小鼠抑郁樣行為與中縫背核BDNF mRNA相關性分析結果CUS所致小鼠抑郁樣行為與總BDNF mRNA相關性分析結果顯示，CUS組小鼠糖水偏好值與總BDNF mRNA存在顯著正相關性(P<0.05)，見圖4A，CUS組小鼠強迫游泳實驗不動時間與總BDNF mRNA存在顯著負相關性(P<0.05)，見圖4B。Shapiro-Wilk檢驗各組數據均符合正態分布(P>0.05)。

2.5 CUS組和Control組小鼠中縫背核BDNF exons mRNA表達量與Control組比較，CUS組BDNF Exon I mRNA表達量沒有顯著變化(t=0.509，P>0.05)，見圖5A； Exon II mRNA表達量沒有顯著變化(t=0.916，P>0.05)，見圖5B； Exon IV mRNA表達量明顯降低(t=2.798，P<0.05)；Exon VI mRNA表達量明顯降低(t=2.419，P<0.05)。Shapiro-Wilk檢驗各組數據均符合正態分布(P>0.05)。

圖2 BDNF和5-HT免疫熒光雙標結果 ×200A：有一抗組；B：無一抗組；1：BDNF蛋白染色；2：5-HT染色；3：BDNF和5-HT染色合并圖

圖3 CUS組和對照組小鼠中縫背核BDNF mRNA和蛋白表達水平

A： BDNF mRNA水平；與Control組比較：*P<0.05；B：BDNF蛋白水平Western blot圖；C：BDNF蛋白水平Western blot統計圖；與Control組比較：*P<0.05

圖4 CUS所致小鼠抑郁樣行為與中縫背核BDNF mRNA相關性分析

A：SPT與BDNF mRNA相關性分析結果；B：FST與BDNF mRNA相關性分析結果

圖5 CUS組和Control組小鼠中縫背核BDNF exons mRNA表達水平

A：Exon I；B:Exon II；C：Exon IV；D：Exon VI；與Control組比較：*P<0.05

3 討論

人類抑郁癥的核心癥狀是快感缺乏癥，即無法體驗快樂。對蔗糖溶液的偏好超過了對水的偏好實驗已被用作衡量嚙齒動物對自然獎勵的快感反應，而被強迫游泳實驗被廣泛用于評估絕望行為，其中的不動時間被稱為“絕望”。這兩個行為被廣泛用于抑郁樣和抗抑郁行為的評價[11]。本研究證明CUS能誘導小鼠產生糖水偏好降低和強迫游泳不動時間增加的抑郁樣行為，說明建立的模型能夠反映抑郁癥的主要表型。

BDNF作為一種重要的神經營養因子，其在神經元的分化、再生、存活及神經和突觸可塑性中發揮重要作用[12]。研究[5]報道BDNF在抑郁癥的發病機制和抗抑郁治療中起重要作用，但是其研究腦區主要位于前額葉皮層、海馬、中腦腹側被蓋區及伏隔核等。最近一篇研究[13]報道中縫背核腦區特異性敲除BDNF后小鼠在基礎條件下糖水偏好和強迫游泳實驗均沒有表現出抑郁樣行為。本研究證明中縫背核腦區5-HT神經元與BDNF共存，說明5-HT神經元中有BDNF表達，CUS能導致總BDNF mRNA和蛋白表達量降低，這與抑郁狀態下BDNF在其他腦區的變化一致[14]，說明中縫背核腦區5-HT神經元中的BDNF的確也參與了抑郁癥發病。BDNF有多個剪切體，文獻[5, 15]報道不同剪接體的空間分布和功能不同[15]，但是不同剪切體的具體生物學功能目前尚不清楚，其中Exon IV和Exon VI在精神疾病的發病和治療中發揮更重要的作用，這與本研究結果CUS能特異性降低中縫背核腦區BDNF Exon IV和Exon VI的表達一致，這進一步說明中縫背核腦區BDNF與抑郁癥的發病相關。

綜上所述，本研究證明CUS能顯著誘導小鼠產生抑郁樣行為，中縫背核腦區5-HT神經元中存在BDNF的表達，并且CUS能顯著降低中縫背核腦區BDNF的表達。以上結果提示中縫背核腦區BDNF參與抑郁癥的發病，但是其發揮作用的具體機制還需進一步研究。