kshv-mir-k12-1-5p靶向調控CDKN1A影響卡波西肉瘤的細胞周期

張 靜，彭靖淇，吳秀娟，普雄明

卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma，KS)是內皮細胞起源的惡性腫瘤[1]。卡波西肉瘤相關病毒(KSHV)屬于γ2皰疹病毒[2]，是KS最重要的病原體。KSHV主要通過編碼miRNAs在KS中發揮作用[3]。miRNAs是非編碼小分子RNA[4]。miRNAs通過結合靶基因3′UTR區下調或沉默靶基因的表達[5]。miRNAs調控超過1/3的人類基因[6]，通過復雜的機制在各種細胞過程中發揮重要作用, 廣泛參與腫瘤的形成和發展[7-8]。Wu et al[9]研究顯示 :13個KSHV miRNAs在KS中表達全部上調，其中kshv-mir-k12-1-5p上調最高，KSHV miRNAs主要通過調控或改變細胞周期導致KS的發生[10]，故推測kshv-mir-k12-1-5p可能與細胞周期的調控密切相關。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是功能強大的細胞周期負調控因子。miRNAs通過抑制靶基因的翻譯而發揮其生物學功能[11]。現研究kshv-mir-k12-1-5p對靶基因(CDKN1A)的抑制作用及對KS細胞周期的影響，為KS的靶向治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑卡波西肉瘤細胞株(KS cell line, SLK)(美國NIH AIDS Research and Reagent Program提供); 293T cells(美國Open Biosystems公司)；雙熒光素酶報告系統試劑盒(美國Promega公司)；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)；kshv-mir-k12-1-5p 模擬物(mimics)、kshv-mir-k12-1-5p抑制物(inhibitor)、mimics陰性對照(NC)、inhibitor NC(上海吉瑪技術有限公司)；RIPA裂解液、細胞周期分析試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；CDKN1A、GAPDH、HRP(美國Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和轉染 使用對數生長期細胞密度為80%的SLK細胞(KS細胞)。將SLK細胞按每孔2×105細胞接種于96孔板中，培養24 h。Western blot、qRT-PCR及細胞周期PI實驗均分5組進行：mimics組、inhibitor組、mimics NC組、inhibitor NC組、正常細胞組(normal cell group)。使用Lipofectamine 2000轉染試劑將實驗5組分別轉染到SLK中，轉染時間為48 h。

1.2.2雙熒光素酶實驗 將野生型(WT)和突變型(MUT) CDKN1A 3′UTR擴增并構建為pYr-mirTarget重組質粒。然后用Lipofectamine 2000轉染試劑將重組質粒(1 μg)和kshv-mir-k12-1-5p mimics、mimics NC(50 nmol/L) 共轉染293T細胞(5×104)。轉染24 h后，使用雙熒光素酶測定系統檢測熒光素酶相對活性。

1.2.3Western blot(WB)檢測 使用400 μl RIPA裂解液(50 mmol/L Tris/pH7.4、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、sodium orthova-nadate、sodium fluoride、EDTA、leupeptin)提取細胞總蛋白。根據蛋白質含量，繪制標準曲線。制備層疊凝膠(5%)和分離凝膠(12%)。然后進行電泳(1.5 h、100 V)。當溴酚藍到達凝膠板底部時，電泳結束。將蛋白轉移到膜上，整個過程持續70 min，用脫脂奶粉(5%)阻斷膜2 h。一抗CDKN1A稀釋(1 ∶1 000)、GAPDH稀釋(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。HRP二抗稀釋(1 ∶10 000)在37 ℃下孵育2 h、使用增強化學發光成像。利用BandScan進行灰度值分析。

1.2.4實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測 使用1 ml TRIzol提取細胞總RNA。用 miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒檢測mRNA和miRNA的表達水平。大約3 μg的總RNA用于互補DNA(cDNA)的合成。使用2 μl的cDNA進行PCR擴增。反應條件為：95 ℃ 30 s ; 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 32 s，40個循環; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，運用2-ΔΔCt相對定量法進行數據分析。CDKN1A引物(F：5′-CCCGTGAGCGATGGAACTT-3′；R：5′CGAGGCACAAGGGTACAAGAC-3′)；以GADPH作為對照 (F：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′；R：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′)；kshv-mir-k12-1-5p引物(F：5′-TGCGCATTACAGG AAACTGGGTG-3′； R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAG GTATT-3′；莖-環結構引物(stem-loop)：5′-GTCG TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACGCTTACAC-3′)。以U6作為對照(F：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′；R：5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′)。

1.2.5細胞周期(PI法)測定 將kshv-mir-k12-1-5p mimics、inhibitor等(50 nmol/L)分別轉染到SLK細胞中。48 h后獲得2×105個細胞。用200 μl的細胞液離心5 min，用PBS洗滌細胞2次。隨后，細胞在-20 ℃下用75%乙醇固定1 h，在4 ℃下預冷。用冷PBS再次清洗細胞。細胞周期分析試劑盒的使用方法參照生產廠家提供的說明書，將Rnase A溶液(20 μl)加入細胞，37 ℃下置于水浴中30 min，然后將PI染料溶液(400 μl)加入混合物中，4 ℃下在黑暗中孵育。采用流式細胞術檢測，檢測波長488 nm。(PI值=S+G2/G1+S+G2，其中PI為增殖活性指數。PI值越大，細胞周期進程越快，細胞周期時間越短，細胞增殖越快。)

2 結果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的轉染水平將kshv-mir-k12-1-5p mimics、 inhibitor等分別轉染到SLK細胞中，qRT-PCR結果顯示，mimics組kshv-mir-k12-1-5p轉染水平最高(4.43±0.07), inhibitor組kshv-mir-k12-1-5p轉染水平最低(0.72±0.02)。各組轉染水平的差異有統計學意義(F=2 971.42，P<0.01)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測kshv-mir-k12-1-5p的轉染水平

1：normal cell group; 2：mimics 組; 3：inhibitor組；4:mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與 mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

2.2 CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-K12-1-5p的結合位點預測通過Mirbase(http://www.mirbase.org/)靶基因預測軟件分析，從數百個靶基因中選擇CDKN1A作為kshv-mir-K12-1-5p的靶基因驗證，因為CDKN1A與細胞周期調控密切相關，是功能強大的細胞周期負性調控因子。圖2顯示了CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-K12-1-5p的種子區序列(Seed sequence)的結合位點。

2.3 kshv-mir-k12-1-5p特異靶向CDKN1A293T細胞分別轉染kshv-mir-k12-1-5p mimics+CDKN1A-WT、mimics NC+CDKN1A-WT、kshv-mir-k12-1-5p mimics+CDKN1A-MUT和mimics NC+ CDKN1A-MUT。24 h后測定熒光素酶的相對活性。kshv-mir-k12-1-5p mimics和CDKN1A-WT共轉染后，相對熒光素酶活性降低(4.56±0.18)；kshv-mir-k12-1-5p mimics和CDKN1A-MUT共轉染后，相對熒光素酶活性無明顯變化(7.11±0.17)。 mimics NC和CDKN1A-WT/ CDKN1A-MUT轉染后相對熒光素酶活性無明顯影響[(6.29±0.19)vs(7.04±0.21)]。各組熒光素酶的相對活性差異有統計學意義(F=28.31，P<0.01)。因此，CDKN1A是kshv-mir-k12-1-5p直接作用的靶基因。見圖3。

圖2 CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-k12-1-5p的結合位點

圖3 各組相對熒光素酶活性

1：mimics+CDKN1A-WT組；2：mimics NC+CDKN1A-WT組；3：mimics+CDKN1A-MUT組；4：mimics NC+CDKN1A-MUT組；與mimics+CDKN1A-WT組比較：**P<0.01

2.4 kshv-mir-k12-1-5p負性調控靶基因CDKN1A的表達轉染kshv-mir-k12-1-5p mimics后，SLK細胞中CDKN1A的蛋白表達水平顯著低于其余4組；轉染kshv-mir-k12-1-5p inhibitor后，SLK細胞中CDKN1A的蛋白表達水平顯著高于其余4組；轉染kshv-mir-k12-1-5p mimics后，SLK細胞中CDKN1A mRNA的表達水平顯著低于其余4組；轉染kshv-mir-k12-1-5p inhibitor后，SLK細胞中CDKN1A mRNA的表達水平顯著高于其余4組。各組CDKN1A的蛋白水平(F=76.10，P<0.01)和mRNA表達水平(F=83.31，P<0.01)差異有統計學意義。因此，kshv-mir-k12-1-5p可以負調控靶基因CDKN1A的表達。見圖4。

2.5 kshv-mir-k12-1-5P對SLK細胞周期的影響轉染SLK細胞48 h后，用流式細胞術檢測細胞周期分布情況。結果顯示:與其余4組比較，kshv-mir-k12-1-5p mimics組PI值最高，G1期細胞數量最少，S+G2期細胞數量最多；與其余4組比較，kshv-mir-k12-1-5p inhibitor組PI值最低、G1期細胞數量最多、S+G2期細胞數量最少。各組PI值差異有統計學意義(F=220.01，P<0.01)。因此，kshv-mir-k12-1-5P可加速細胞周期進程，縮短細胞周期時間，促進細胞增殖，促進G1/S期轉換。見圖5。

圖4 kshv-mir-k12-1-5p負性調控靶基因CDKN1A的表達

A：Western blot法檢測結果圖；B：CDKN1A蛋白相對表達量；C：CDKN1A mRNA 相對表達量；1：normal cell group; 2：mimics組; 3：inhibitor組；4:mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

3 討論

卡波西肉瘤是間葉源性高度播散的血管肉瘤[1]。其在中國新疆高發，主要見于維吾爾族和哈薩克族。KS與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、KSHV、血管生成細胞分化和遺傳易感性有關。KSHV是導致人類惡性腫瘤的七種病毒之一,可引起人類宿主終身感染，是KS的重要致病因子。KSHV主要通過編碼的miRNAs發揮作用，KSHV miRNAs對宿主細胞的周期及自身周期均有重要的調控作用，最終可以誘導腫瘤的發生[10]。

Catrina Ene et al[12]通過基因芯片分析了17例KS樣本與3例正常皮膚樣本中miRNAs的表達差異，結果顯示：kshv-mir-k12-4-3p、kshv-mir-k12-1在KS中表達明顯上調，Wu et al[9]通過KS及瘤旁組織中miRNAs表達差異譜分析得出：69個miRNAs在KS中表達明顯上調，101個miRNAs表達明顯下調。其中kshv-mir-k12-1-5p表達上調最為明顯。因此高表達的kshv-mir-k12-1-5p可能與KS的細胞調控密切相關，但需要進一步驗證。miRNAs 的功能研究關鍵在于其靶基因的確定。因為miRNAs通過抑制靶基因的功能來發揮生物學作用[11]。如KSHV感染的淋巴瘤細胞中KSHV miRNA調控的潛在靶基因在該病的發病機制中起關鍵作用[13]。

圖5 kshv-mir-k12-1-5P對SLK細胞周期的影響

A：細胞周期分布；B：細胞周期PI值(%)；1：normal cell group; 2：mimics組; 3：inhibitor組；4：mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與 mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

CDKN1A是細胞周期相關基因，位于6號染色體上。作為一種抑癌基因，在腫瘤中廣泛低表達。細胞周期有兩個重要的檢查點：G1/S期和G2/M期。從細胞周期進程來看，G1/S期的檢查點調控比G2/M期更為重要。CDKN1A主要作用于G1/S期檢查點[14]，抑制G1期向S期進展。與P53間接作用細胞周期不同，CDKN1A直接與 Cyclin / CDK復合蛋白或CDK蛋白激酶結合，負性調控細胞周期。當受到化學或物理刺激時，CDKN1A可以修復損傷的DNA，如果CDKN1A受到抑制，細胞沒有完全修復直接進入細胞周期，復制錯誤遺傳信息，將導致腫瘤的發生[15]。

本研究通過檢測熒光素酶表達活性確定了kshv-mir-k12-1-5p可特異性地作用于CDKN1A-3′UTR的結合位點，CDKN1A是kshv-mir-k12-1-5p作用的靶基因。通過體外細胞實驗發現: kshv-mir-k12-1-5p表達上調時，SLK細胞中CDKN1A 的蛋白和mRNA表達水平均明顯下降；kshv-mir-k12-1-5p表達下調時，CDKN1A 的蛋白及mRNA表達水平明顯升高，可見kshv-mir-k12-1-5p能負性調控 CDKN1A的表達。此外，本研究應用細胞周期PI法分析kshv-mir-k12-1-5p對KS細胞周期的影響，結果表明：kshv-mir-k12-1-5p過表達后KS細胞的G1期細胞數量明顯減少，S期和G2期細胞數量明顯增加;抑制kshv-mir-k12-1-5p表達后，KS細胞發生G1期細胞阻滯，S期和G2期細胞數量明顯減少。因此kshv-mir-k12-1-5p可以促進KS細胞G1/S期轉換，加速細胞周期的進程。下一步本課題組將進行體內動物實驗，明確 kshv-mir-k12-1-5p和靶基因共同參與KS發生、發展的機制，為KS的治療提供理論依據和技術支持。

綜上，kshv-mir-k12-1-5p可能通過下調或沉默靶基因CDKN1A的表達發揮細胞周期調控作用。它具有促癌基因的功能，正性調控KS的細胞周期，縮短細胞周期時間，促進G1/S期轉換。導致細胞周期調控紊亂，誘導KS的發生。而抑制kshv-mir-k12-1-5p的表達有可能成為KS的一個新的治療靶點。