甲狀腺功能紊亂對雌性小鼠血糖的短期影響

汪 洋，余 婷，陳可洋

甲狀腺功能紊亂(thyroid dysfunction, TD)，即甲狀腺功能亢進和甲狀腺功能減退，女性比男性患病率高。女性青春期必需營養物質碘的需求增加，甲狀腺激素對生長發育有重要意義。甲狀腺激素在青春期生殖系統的適當發育和功能中發揮重要作用[1]。甲狀腺激素對生長也存在不可忽視的作用。目前研究[2]提示青春期甲狀腺激素水平與骨質發育有關聯，青春期甲狀腺功能亢進患者可嚴重影響青少年的骨代謝，導致骨轉換加速，骨密度降低。

甲狀腺激素在葡萄糖代謝中起重要作用。正常機體胰島素分泌通過葡萄糖感受器調節，甲狀腺激素分泌同時影響胰島素[3]。三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)是生物活性激素，80%循環T3是活化的脫碘酶和單體碘化的四碘甲狀腺原氨酸(thyroxine, T4)在外周轉化而來，它主要負責葡萄糖代謝活動[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與實驗動物3周齡C57BL/6J雌性小鼠(9～12 g)30只，從北京維通利華(Vital River)公司購買。游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free thyroxine , FT4)試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液購自江蘇碧云天生物技術有限公司；葡萄糖-6-磷酸激酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)購自美國Thermo Scientific公司，磷酸烯醇式丙酮酸激酶(phosphoenol- pyruvate carboxykinase, PPEPCK)購自美國cell signling technology公司；蛋白質印跡試驗二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

試驗前動物自由進食標準飼料，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節律。實驗室溫度：20～25 ℃，濕度：(50±5)%。在上述環境適應1周后，將小鼠隨機分成3組：N組(正常對照組)10只、Pe組(甲狀腺功能亢進組)10只、Po組(甲狀腺功能減退組)10只。

左旋甲狀腺素配置成溶液，按1.2 mg/kg灌胃處理小鼠28 d造甲狀腺功能亢進模型；丙基硫氧嘧啶配置成溶液，按20 mg/kg灌胃處理小鼠28 d造甲狀腺功能減退模型。同時普通對照組動物灌胃等量生理鹽水。實驗期間動物自由進食、飲水，適應性喂養1周后每周測血糖水平及體質量至8周取材。

本實驗嚴格遵循“NIH實驗用動物管理和使用指南”，盡量減少實驗動物痛苦和減少實驗動物數量，禁止虐待動物。8周后，將從雌性小鼠獲得的全血在3 000 r/min、4 ℃下離心20 min以收集血清。獲得的肝臟立即放入液氮中冷凍，并儲存在-80 ℃待提取組織蛋白備用。

1.2 生化指標檢測以及蛋白質印跡實驗甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退小鼠在造模28 d后每組取3 只，使用ELISA試劑盒分析血清FT3、FT4確保造模成功，同時N組取3只小鼠測相同指標作對照。蛋白質印跡試驗檢測肝臟組織中G6Pase、PEPCK的表達水平。

通過蛋白質印跡試驗測定靶蛋白的表達水平。用含有完全蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液制備肝勻漿。將裂解物在12 000 r/min、4 ℃下離心15 min。通過BCA測定法定量上清液提取物的蛋白質濃度。將蛋白質原液定量配制成上樣緩沖液，100 ℃下10 min變性，然后放在-20 ℃下保存。

對蛋白質進行分析，加入30～50 μg溶解的蛋白質，通過10%～15% SDS-PAGE電泳分離(約2 h)并轉移至PVDF膜(約2.5 h)，然后將載有目的蛋白的PVDF膜在室溫(25 ℃)浸沒于5%脫脂乳中孵育1 h，純水洗滌后與一抗G6Pase、PEPCK孵育。在搖床上過夜(4 ℃)。然后TBST洗滌膜并在室溫下與二抗孵育1～2 h，通過增強化學發光(ECL)檢測靶蛋白。為了量化蛋白質表達水平，在Image J軟件上對應于每個樣品的印跡強度獲得密度測定的圖下面積。即獲得目的蛋白條帶，分析比較不同組間的差異。

2 結果

2.1 血清FT3、FT4檢測造模28 d后，每組分別取3只小鼠測血中FT3、FT4，以判斷甲狀腺功能亢進甲狀腺功能減退造模是否成功。經試劑盒檢測N組FT3濃度為(55.40±5.15)pmol/L，Pe組FT3濃度為(85.25±5.35)pmol/L，Po組FT3濃度為(20.72±2.23)pmol/L。N組FT4濃度為(58.41±3.53)pmol/L，Pe組FT4濃度為(86.07±2.39)pmol/L，Po組FT4濃度為(20.83±2.50)pmol/L。與N組相比，Pe組FT3、FT4水平升高(t=4.02,P<0.05;t=6.49,P<0.01)，Po組FT3、FT4水平降低(t=6.18,P<0.01;t=8.69,P<0.01)。見圖1。

2.2 體質量及血糖檢測造甲狀腺功能亢進甲狀腺功能減退模型從雌性小鼠青春期(4周齡)起，Pe組體質量從造模21 d逐漸與Po組、N組拉開距離，生長加快。造模結束(28 d)N組體質量(18.23±0.13)g，Pe組體質量(20.20±0.56)g，Po組體質量(16.77±0.23)g。與N組相比，Pe組體質量水平升高(t=3.45,P<0.01)，Po組體質量水平降低(t=5.71,P<0.01)。

圖1 各組血清FT 3、FT 4檢測與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

造甲狀腺功能亢進甲狀腺功能減退模型從雌性小鼠青春期(4周齡)起，Pe組血糖從造模7 d逐漸與N組、P0組拉開距離，血糖降低；Po組血糖從造模14 d逐漸與N組拉開距離，血糖升高。造模結束(28 d)N組血糖(5.23±0.26)mmol/L，Pe組血糖(4.12±0.22)mmol/L，Po組血糖(7.33±0.58)mmol/L。與N組相比，Pe組血糖水平降低(t=3.30,P<0.01)，Po組血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)。甲狀腺功能亢進鼠呈低血糖狀態，甲狀腺功能減退鼠呈高血糖狀態，見圖2。

2.3 肝臟組織中G6Pase、PEPCK的表達G6Pase和PEPCK是催化糖原異生的決定性蛋白，因此在葡萄糖穩態中起關鍵作用。G6Pase蛋白的表達在各組有差異。與N組相比，Pe組蛋白表達水平升高(t=8.50,P<0.01)，Po組體蛋白表達水平升高(t=3.40,P<0.05)。PEPCK蛋白的表達略有不同。與N組相比，Pe組蛋白表達水平升高(t=14.92,P<0.01)，Po組蛋白表達無差異(t=2.43,P>0.05)，見圖3。

3 討論

3.1 甲狀腺激素對青春期生長的短期影響甲狀腺激素被稱為代謝、生長發育的調節劑，促進雌性小鼠青春期生長。甲狀腺功能亢進導致青春期雌性小鼠體質量增加迅速，甲狀腺功能減退導致體質量增加緩慢。Shiraki et al[5]研究發現甲狀腺功能減退導致體質量降低，Kiyohara et al[6]研究結果表明甲狀腺功能減退狀態可能對青春期發育產生負面影響，體質量增長的變化與本研究結果一致。甲狀腺激素紊亂對雌性小鼠不同生長階段作用略有區別，有研究[7]指出老年雌性甲亢甲減小鼠體質量均降低，這可能是由于青春期促生長作用更明顯。流行病學調查顯示，兒童期缺乏甲狀腺激素是矮小癥患兒發病的重要原因[8]。研究[1]表明下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸之間存在相互作用。青春期是重要的生長發育時期，甲狀腺激素紊亂對其影響不僅僅體現在生長方面，而且對女性青春發動期的性腺發育及性器官成熟有重要意義。本研究的不足之處在于沒有進一步探究對雌性小鼠青春期發育的影響。

圖2 體質量及血糖檢測

A：造模期體質量；B：造模期血糖；C：造模28 d體質量；D：造模28 d血糖；與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 肝臟組織中G6P、PEPCK的表達

A：肝臟組織中G6P、PEPCK的蛋白條帶；B：肝臟組織中G6P、PEPCK各自與β-actin的比值；與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 甲狀腺激素與糖異生相關蛋白的表達甲狀腺激素與能量代謝的調節密切相關，與糖代謝的調節也是密不可分。甲狀腺功能亢進狀態下，葡萄糖氧化率增加，胰島素敏感性降低[9]。有研究[10]表明甲狀腺素可增加大鼠卵巢中葡萄糖轉運蛋白4表達。甲狀腺激素通過這些可能的途徑影響糖代謝水平。

與N組相比，甲狀腺功能亢進小鼠G6Pase蛋白表達水平升高(t=8.50,P<0.01)，PEPCK蛋白表達水平升高(t=14.92,P<0.01)。這兩種催化糖原異生的蛋白表達水平升高，糖異生增強。然而甲狀腺功能亢進小鼠血糖水平卻降低，可能是由于葡萄糖氧化率增加，葡萄糖轉運蛋白表達水平提高導致糖異生的速度趕不上葡萄糖消耗的速度，能量用于生長所需以及維持加速的循環系統運轉。

與N組相比，甲狀腺功能減退小鼠G6Pase催化糖原異生的蛋白表達增強(t=3.40,P<0.05)，糖異生增強。同時甲狀腺功能減退會降低胃腸道葡萄糖的吸收，肝臟葡萄糖生成幾乎完全停止以及胰島素水平增加[9]。甲狀腺功能減退小鼠血糖水平升高明顯，可能是由于葡萄糖生成途徑增加以及能量代謝減慢疊加的效果。

3.3 甲狀腺激素與血糖水平的意義一項對德國和奧地利276名兒童和青少年1型糖尿病(diabetes mellitus type 1, T1DM)患者的甲狀腺功能亢進癥調查表明，伴有甲狀腺功能亢進的T1DM患者低血糖發生率更高[11]。甲狀腺功能亢進與胰島素不足是否存在相關性值得引起注意，更高的低血糖發生率對伴有甲狀腺功能亢進的T1DM患者并發癥防治具有前瞻性意義。格雷夫斯眼病(自身免疫性甲狀腺相關性眼病)患者存在自發性低血糖。青春期甲狀腺功能亢進可能需預防低血糖的風險。

有隊列研究[12]表明甲狀腺功能減退是新發糖尿病的危險因素。與N組相比，該研究中雌性小鼠的血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)，青春期甲狀腺功能減退存在發展成為2型糖尿病的潛在風險，高血糖的持續狀態甚至可能影響雌性小鼠成年期。

甲狀腺疾病對青春期女性的危害不容忽視。但甲狀腺激素水平影響糖脂代謝的信號通路的哪些環節，相關分子機制需要進一步的探索。這或許為女性青春期甲狀腺功能紊亂治療提供新的視角。