高效液相色譜-串聯質譜法測定黃瓜中啶蟲脒殘留

楊帆 ，李璇 ，2，司升云

（1.武漢市農業科學院蔬菜研究所，430345；2.華中農業大學植物科學技術學院）

啶蟲脒（acetamiprid）是繼吡蟲啉和烯啶蟲胺后發現的第3個優良的氯化新煙堿類殺蟲劑[1]。該藥劑作用于昆蟲綱神經系統后突觸的乙酰膽堿受體，有觸殺、胃毒和較強的滲透作用，殺蟲廣譜、持效期長、內吸性強，在土壤中穩定性好[2,3]。啶蟲脒的作用機制與傳統的有機磷類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類不同，故對傳統殺蟲劑有抗性的害蟲有特效，是有機磷酸酯類農藥的有效代替品[4]。近年來，啶蟲脒在黃瓜等蔬菜作物上廣泛應用，歐盟目前規定的啶蟲脒在果菜類蔬菜中的最大殘留限量值（maximum residue limit，MRL）為0.3 mg/kg，日本規定其在黃瓜上的MRL值為5 mg/kg，我國在GB 2763-2019中最新規定啶蟲脒在黃瓜中的MRL值為1 mg/kg[5]。在國家對啶蟲脒生物安全性評價及殘留限量標準進一步規范后，啶蟲脒殘留分析的檢測方法也需進一步完善。

目前啶蟲脒殘留分析的常用檢測方法有氣相色譜法（gas chromatographic，GC）[6，7]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8，9]和氣相色譜-質譜法 （gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）[10～12]，但這些方法多需要其他手段輔助，操作過程較為復雜。液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）使得農藥殘留測定的精確度更高，逐漸成為農藥殘留分析發展的新趨勢。但是LC-MS技術成本較高，而且此方法普遍存在基質效應，如果在樣品前處理、內標使用、色譜分離和質譜分析等過程中參數選擇不當，會直接影響該方法的靈敏度和精確度。已有研究使用液質聯用技術對茶葉中啶蟲脒進行殘留分析[13～15]，也有該技術在大田作物[16]及果蔬[17～20]農藥殘留測定中應用的報道。本研究采用高效液相色譜-串聯質譜法 （high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS） 測定了黃瓜植株、果實和土壤中的啶蟲脒殘留，對樣品前處理方法進行了改良，并建立了基于定量離子的多重反應監測模式，該方法操作簡便、準確性高。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啶蟲脒標準品（Sigma公司）；20%啶蟲脒可溶性液劑（上海生農生化制品股份有限公司）；色譜級甲醇（Tedia公司）；十八烷基鍵和硅膠吸附劑C18、乙二胺基-N-丙基吸附劑PSA、石墨化炭黑吸附劑GCB、乙腈、乙酸、甲酸（國產色譜純）、無水乙酸鈉、無水硫酸鎂、乙酸銨（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY UPLC高效液相色譜儀（Waters公司）；Xevo TQ 質譜儀（Waters公司）；臺式高速離心機（德國SORVAL公司）；AR5120電子天平（美國AHOMS公司）；IKAT18勻漿機 （德國IKA公司）；UYC-200全溫培養搖床 （上海新苗醫療器械制造有限公司）；氮吹儀（杭州米歐儀器有限公司）；超綠16型背負式手動噴霧器（西班牙MATABI公司）。

1.3 試驗方法

①樣品前處理 準確稱取10.00 g（精確至0.01 g）已均質的樣品于50 mL離心管，加入3顆玻璃彈珠及 15 mL 乙腈（含 1%乙酸，乙腈∶乙酸=99∶1），渦旋振蕩2 min，加入1 g無水乙酸鈉和4 g無水硫酸鎂的混合萃取填料，迅速手搖震蕩30 s至充分混勻；3 800 r/min離心3 min，取6 mL上清液于15 mL離心管待凈化；向提取液中加入300 mg PSA、300 mg C18、22.5 mg GCB、900 mg 無水硫酸鎂，渦旋震蕩30 s；3 800 r/min 離心 3 min，取 1.5 mL 上清液于10 mL玻璃試管中；55℃溫浴氮吹至溶液近干，而后以甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待UPLC-MS/MS檢測。

②標準溶液配制 以甲醇為溶劑配制梯度為2、5、20、50、200、500、1 000 μg/L 的啶蟲脒標準溶液。

③色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC R BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫 40℃。流動相 A：98/2=水/[甲醇（V/V）+0.05%甲酸+5 mmol/L乙酸銨]；流動相 B：乙腈；流速 0.3 mL/min；進樣量5 μL；樣品室溫度10℃。液相梯度參數見表1。

④質譜條件 電離方式為電噴霧電離 （ESI）正負離子切換；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度150℃；錐孔反吹氣流量50 L/hr；脫溶劑氣溫度400℃；脫溶劑氣流量800 L/hr；監測模式為多重反應監測（MRM）模式。質子化的選擇反應監測條件（[M+H]+）見表2。

表1 液相梯度參數

表2 質子化的選擇反應監測條件（[M+H]+）

1.4 實際樣品檢測

按照本方法檢測啶蟲脒在大棚黃瓜果實和土壤中的殘留量。

①小區設計 設殘留低劑量處理區和殘留高劑量處理區，以生產中20%啶蟲脒可溶性液劑葉面噴霧法防治黃瓜瓜蚜的推薦劑量 （有效成分72 g/hm2）和2倍推薦劑量（有效成分144 g/hm2）分別作為最終殘留試驗的低劑量和高劑量。每個處理3次重復，每次重復為1個小區，每個小區面積15 m2，各小區之間設保護行。設空白對照小區，并與處理區設有效隔離帶，以避免藥劑的揮發、漂移和淋溶污染。

表3 啶蟲脒在黃瓜樣品中的加標回收率和相對標準偏差

②施藥方法及樣品采集 于瓜蚜發生盛期開始施藥，間隔期10 d，共施藥3次。最后1次施藥后1、2、3、5、7 d分別采集黃瓜果實和土壤樣品，用于啶蟲脒含量測定。每個小區隨機采集成熟、健康、無病害果實不少于2 kg，去除果梗后裝入自封袋；用土壤取樣器隨機采集0～10 cm深的地表土，每小區設3個取樣點，總取樣量不少于1 kg，去除雜質后裝入自封袋。所有樣品攜至室內采用四分法縮分后各留樣200～500 g，用錫箔紙包好裝入自封袋，保存于-20°C低溫冰箱中，待測。

2 結果與分析

2.1 提取凈化方法改良

乙腈是農藥提取最常用的溶劑，對多種有機農藥的提取效果都十分明顯，本試驗采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黃瓜中啶蟲脒，改用無水乙酸鈉和無水硫酸鎂去除水分，除加入C18、PSA填料凈化外，改良加入GCB對提取液吸附凈化，最后以氮氣吹掃方式濃縮樣品。這種方法流程簡便，提取過程中對待測物損失較小。

2.2 質譜條件的選擇

啶蟲脒為弱酸性煙堿類化合物，適宜選擇正離子模式進行檢測。啶蟲脒共檢測223/126.0和223/56.1共2個碎片離子，其中223/126.0選為定量離子，以該離子檢測響應值對樣品中啶蟲脒定量；223/56.1碎片離子為定性離子。

2.3 線性關系的確定線性范圍與靈敏度

將配制的系列標準溶液在優化的色譜和質譜條件下進行檢測，檢測結果以峰面積Y對質量濃度X（μg/L）作校準曲線，結果如圖1所示。啶蟲脒在2～1 000 μg/L濃度范圍內線性關系良好，校正曲線為Y=939.092 X+62.353 1，相關系數（R2）大于 0.999。 定量限為 0.25 μg/kg，檢出限為 0.05 μg/kg。

圖1 啶蟲脒在濃度范圍內的校準曲線

2.4 回收率與準確度

本方法中啶蟲脒檢出限低于MRL值（1 mg/kg），因此設置添加水平為0.5倍、1倍和2倍MRL值，即以黃瓜空白樣品中添加500、1 000、2 000 μg/kg 3 個水平的啶蟲脒進行回收率試驗。每個添加水平進行6次重復。表3結果表明，平均回收率為88.8%～106.6%，相對標準偏差 （RSD）為2.3%～7.0%，符合GB/T 27404-2008中回收率范圍在80%～110%的規定。說明此方法的回收率較高，符合殘留分析要求。黃瓜樣品空白及最低添加水平的樣品添加的多反應監測色譜圖見圖2。

2.5 實際樣品檢測

在建立了啶蟲脒的HPLC-MS/MS定量分析方法及相應的樣品前處理技術后，按本方法檢測了啶蟲脒在大棚黃瓜果實和土壤中的殘留量。結果表明，黃瓜果實中啶蟲脒的最終殘留量范圍為0.012 1～0.048 5 mg/kg，土壤中啶蟲脒的最終殘留量范圍為0.000 5～0.050 9 mg/kg。說明該方法精度較高，完全能滿足實際檢測需要（圖3）。

圖3 啶蟲脒低劑量和高劑量處理下在黃瓜果實（a）和土壤（b）中的最終殘留量

3 結論

本研究采用乙腈（含1%乙酸）溶液提取黃瓜中啶蟲脒，提取效果十分優良。提取液改用無水乙酸鈉和無水硫酸鎂去除水分，除加入C18、PSA填料凈化之外，改良加入GCB對提取液吸附凈化，最后以氮氣吹掃方式濃縮樣品。這種方法流程簡便，提取過程中對待測物損失較小，提取物更加純凈，不用過多的凈化步驟就可準確測出大部分痕量待測物，大大縮短了單個樣品的檢測時間。質譜采用ESI為離子源，經MRM監測模式掃描，選定223/126.0為定量離子，以該離子檢測響應值對樣品中啶蟲脒定量，最大程度的降低了基質干擾對定量分析的影響。檢出限為0.05 μg/kg，具有很高的準確度和精密度，且在2～1 000 μg/L濃度范圍內線性關系良好，相關系數大于0.999，平均添加回收率為88.8%～106.6%，相對標準偏差為2.3%～7.0%，實際樣品檢測精度可達0.001 mg/kg，符合國家殘留分析方法測試要求。