基于Warfarindosing網站預測漢族人群華法林給藥劑量與實際劑量的相關性研究

李 強，鄧艷輝，韋美丹，段萍萍，吳麗瑤，陳文瑛

0 引言

華法林(Warfarin)是目前臨床一線香豆素類口服抗凝藥，但是其用藥劑量受遺傳因素和藥物相互作用等非遺傳因素影響[1-2]。藥物代謝CYP2C9與維生素K環氧化物還原酶(VKORC1)是目前公認影響華法林給藥劑量個體差異最主要的遺傳因素[3]。與常規給藥策略相比，基因檢測指導華法林給藥劑量可提供更好的安全性和減少出血風險[4]。目前，針對中國人群CYP2C9*3及VKORC1基因多態性預測華法林劑量的模型，因其樣本量小未被廣泛應用，Warfarindosing網站常被用于預測患者華法林劑量[1,5]。該網站由華盛頓醫學中心的Barnes-Jewish醫院和美國國立衛生研究院等機構提供支持，其研發團隊有華法林劑量精細化協會和國際華法林遺傳藥理學協會(IWPC)的生物統計學家、遺傳學家、藥師和醫生構成，其估算的華法林劑量基于1 000余例患者的統計數據[1]。本研究為比較中國漢族基于VKORC1及CYP2C9基因多態性利用Warfarindosing網站預測患者華法林劑量與實際劑量的差異，以了解Warfarindosing網站在預測中國漢族患者服用華法林劑量的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集廣州某三甲醫院2017年7月至2018年11月所有進行華法林基因檢測的患者相關資料，包括性別、年齡、體重、身高、合并用藥及疾病狀態、服用華法林劑量和INR等。

1.2 基因分型 采用原位雜交熒光染色DNA測序技術檢測患者CYP2C9*3、VKORC1(-1639G>A)基因型，具體操作:①取1.5 ml Eppendorf(EP)管加入1 ml氯化銨處理液與200 μl全血樣本(EDTA抗凝)上下顛倒10 次混勻，然后室溫靜置5 min。②將樣本放入離心機中，3 000 r/min離心5 min。③去上清液后EP管底部可見約2 mm×2 mm的白細胞沉淀，若團塊過小須重復①～③步驟。④向EP管中加入30 μl耀金保(北京華夏時代基因科技發展有限公司)反復吹打混勻，放于室溫靜置30 min，得到白細胞裂解液。⑤取1.5 μl白細胞裂解液加入CYP2C9*3、VKORC1分析樣品處理試劑(北京華夏時代基因科技發展有限公司)后，置于TL998A熒光檢測儀中檢測。⑥采用數字原位雜交熒光染色分析系統，自動判讀熒光信號值，獲取熒光曲線圖，進行CYP2C9*3、VKORC1基因分型，同時做陽性質控，判讀各樣本基因型。記錄相關數據，使用Warfarindosing網站計算華法林周劑量，比較華法林預測周劑量與華法林實際周劑量的差值，包括絕對差值和百分絕對差值，其中絕對差值=預測周劑量-實際周劑量;百分絕對差值=(預測周劑量-實際周劑量)/實際劑量×100%。另外，為了進一步評價其臨床實用性，計算預測劑量落在實際劑量±20%范圍內(理想劑量)的百分比[6]。以華法林實際周劑量為縱坐標、華法林預測周劑量為橫坐標作散點圖并擬合直線，對華法林維持劑量與預測劑量進行相關性分析，同時以擬合指數R2作為判斷模型準確性的指標，R2小于0.5提示模型準確性較差。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0軟件對數據進行統計學分析，采用Pearson相關進行相關性研究，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本信息 本研究共收集108例患者，血管外科106例、重癥醫學科2例，平均年齡(57.6±16.2)歲，男58例，女48例。47例服用華法林，平均年齡(54.5±14.4)歲，平均體重(63.5±11.3) kg，平均身高(163.7±8.6) cm。吸煙12例，采集到達標INR(1.5～2.5)23例。103例患者診斷為深靜脈血栓形成，3例患者診斷為房顫，1例患者診斷為二尖瓣置換術后，1例患者診斷為雙膝人工關節置換術后;各基因型的分布見表1。

表1 CYP2C9*3和VKORC1(-1639G>A)基因型的頻率分布[例(%)]

按照患者CYP2C9*3基因型不同分為AA型(*1/*1)、AC型(*1/*3)和CC型(*3/*3)，等位基因A和C的頻率分別為0.968、0.032;VKORC1(-1639G>A)基因型分為AA型、GA型和GG型，等位基因G和A的頻率分別為0.139、0.861;所有基因分布符合Hardy-weinberg遺傳平衡(P>0.05)。

2.2 預測劑量與實際劑量的符合情況 篩選檢測基因后服用華法林的病例47例，統計不同基因分型的預測劑量與病例數，以及實際周劑量在符合預測范圍的病例數。根據統計結果，對于服用華法林的47例患者，實際周劑量有38例(80.85%)在預測周劑量范圍內，于Warfarindosing網站預測漢族人華法林劑量比較準確，具有一定的參考意義。CYP2C9*1/*1VKORC1AA型實際周劑量在預測劑量范圍內的比例為82.85%(29/35)，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型實際周劑量在預測劑量范圍內的比例為70.00%(7/10)，由于CYP2C9*1/*3VKORC1AA型和CYP2C9*1/*1VKORC1GG型病例數均為1，因此，其實際周劑量在預測劑量范圍內的結果不納入比較。

2.3 華法林預測周劑量與維持周劑量的相關性 在院INR達標的23例患者中，CYP2C9*1/*1VKORC1AA型患者17例，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型患者6例。CYP2C9*1/*1VKORC1AA型和CYP2C9*1/*1VKORC1GA型預測周劑量分別為(21.37±5.15)、(31.73±8.85)mg，實際維持周劑量分別為(21.29±6.26)、(27.00±6.00)mg，CYP2C9*1/*1VKORC1AA型預測的維持周劑量與實際維持周劑量差異無統計學意義，而CYP2C9*1/*1VKORC1GA型預測的維持周劑量顯著大于實際維持周劑量。比較23例患者實際維持劑量與預測劑量的平均絕對差值和百分絕對差值，結果顯示，模型對CYP2C9*1/*1VKORC1AA預測劑量百分絕對差值均最小(0.08±4.93) mg，見表2。華法林預測劑量與實際劑量存在相關性(P=0.000，r=0.748，R2=0.56)，其相關性曲線見圖1，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型患者(R2=0.78)預測劑量與實際劑量相關性優于CYP2C9*1/*1VKORC1AA型患者。

圖1 華法林模型預測劑量與維持劑量的相關性

3 討論

本文中入選的108 例患者中，CYP2C9*1/*1的頻率為93.52%，CYP2C9*1/*3的頻率為6.48%;VKORC1(-1639G>A)AA基因型的頻率為75.00%;與之前的文獻報道的突變頻率一致[7]。漢族人的基因分布CYP2C9*3主要以AA型、VKORC1(-1639G>A)AA主要以AA型、VKORC1(-1639G>A)AA型的患者對華法林敏感，所需的華法林的維持劑量較小[8]，因此，漢族人對華法林敏感，所需華法林劑量較小。

華法林的預測劑量與實際維持劑量相關系數R2值為0.56，略大于之前報道的采用IWPC模型預測漢族人群華法林劑量與實際維持劑量相關系數(R2=0.53)[9]，表明本研究對納入對象采用Warfarindosing網站預測患者華法林劑量準確性較好，可能與該網站基于IWPC模型考慮患者吸煙、肝功能、目標INR值及基礎INR值等有關，能更多地解釋華法林個體差異。但華法林預測劑量與實際劑量存在偏差，CYP2C9*1/*1VKORC1GA型的預測劑量明顯高于實際維持劑量(P<0.05)，其絕對差值為(4.73±4.50) mg/周，大致符合之前的文獻報道[10]。可能與模型納入人群的基本特征背景與本研究人群的基本特征背景存在差異有關，該研究納入的主要人群為高加索人，而本研究僅檢測了患者CYP2C9和VKORC1基因型。研究表明，華法林的劑量還受CYP1A2、CYP3A4、CYP4F2、APOE、EPHX1和NQO1等基因的調控[11-12]。因此，僅憑CYP2C9和VKORC1基因型計算華法林的預測劑量可能是導致華法林的預測劑量明顯高于其實際維持劑量的原因之一。另外，生活方式、生理病理狀態等非遺傳因素對華法林抗凝治療亦存在顯著影響;如吸煙、飲酒、腹瀉和發熱等均可減弱華法林的抗凝作用[8]。此外，Warfarindosing模型考慮了胺碘酮、氟康唑和阿托伐他汀等通過抑制華法林體內代謝而增強其抗凝作用，還有其他藥物也會影響華法林的抗凝作用，如非甾體抗炎藥如阿司匹林、塞來昔布、布洛芬等可提高華法林游離血藥濃度，增強抗凝作用;銀杏葉提取物、紅花和丹參等活血化瘀類中成藥可抑制血小板聚集，與華法林產生協同抗血栓作用[13]。由于本研究納入的樣本量較小，今后需要更大樣本量對已構建的模型進行驗證或是構建新模型，以更好地解釋華法林劑量的個體差異。

表2 華法林預測周劑量與維持周劑量的相關性

綜上所述，基于Warfarindosing網站預測漢族華法林用藥劑量具有一定的參考價值，可適用于漢族人群，尤其對CYP2C9*1/*1VKORC1AA型漢族患者華法林的周劑量預測準確性較高，具有較高的臨床參考意義;但對于漢族CYP2C9*1/*1VKORC1GA基因型患者，華法林的劑量預測亦存在局限性，有待于進一步臨床研究。