冠脈介入術后患者血清miR-146a的表達及其與阿司匹林抵抗的關系

朱 弢,鄭偉青,王 斌,林江波,金順巧,江建軍*

0 引言

血小板在冠狀動脈疾病的發病機制中起著重要的作用[1]。血小板的激活和聚集參與了動脈粥樣硬化斑塊破裂和經皮冠狀動脈介入治療(PCI)導致的冠狀動脈機械破裂之后的冠狀動脈內血栓增殖過程[1-2]?？寡“逯委熓枪跔顒用}疾病的標準療法。Meta分析顯示，在接受抗血小板治療的高危冠心病患者中，嚴重血管事件的復發率降低了25%[1]。阿司匹林主要抗栓機制是乙?；“逯械沫h氧化酶-1(COX-1)，從而抑制血栓素的合成。然而，有部分患者在服用阿司匹林后未觀察到相同的抗血小板作用，反而出現復發性血栓栓塞，這種現象稱為阿司匹林抵抗(AR)。貧血、高齡、糖尿病、高三酰甘油以及高血壓是冠心病患者發生AR的危險因素。然而，關于miR-146a與冠心病患者PCI術后發生AR的研究十分有限。本研究旨在探討冠心病患者血清miR-146a表達水平與PCI術后發生AR的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年11 月至2018年8月在我院心內科接受PCI治療的冠心病患者。納入標準:①經確診為冠心病，且接受PCI 治療;②年齡≤80 歲;③無手術禁忌證;④入院前未接受阿司匹林治療。排除標準:①對阿司匹林過敏者;②合并出血性疾病、血液系統疾病或有出血傾向者;③術前2周口服抗凝藥(如噻氯匹定、華法林、替格瑞洛等)者;④合并惡性腫瘤、心功能Ⅳ級、嚴重感染、嚴重肝腎功能損害等其他嚴重疾病者。本研究經我院倫理委員會批準，所有研究對象在參與本研究前均已簽署知情同意書。

1.2 抗凝治療方法 PCI術后，所有患者給予口服阿司匹林(批號:J20171021，拜耳醫藥保健有限公司)治療，0.1 g/次，1次/d，持續治療30 d。

1.3 AR診斷標準 根據Gum定義的AR標準，同時滿足以下2個條件者為AR，滿足二者之一者為阿司匹林半抵抗(ASR):①用10 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)作為誘導劑，測得血液中的血小板平均聚集率≥70%;②用0.5 mg/ml花生四烯酸(AA)作為誘導劑，測得血液中的血小板平均聚集率≥20%。AR和ASR統稱為AR[3]。

1.4 血清miR-146a的檢測 于術前抽取患者空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min離心取上清液。采用Trizol試劑盒(Invitogen，Carlsbad，CA，USA)提取總RNA。所得RNA樣品的質量經瓊脂糖凝膠電泳證實。凝膠顯示清晰的28 S、18 S和5 S帶，28 S帶的亮度約為18 S的2倍，表明RNA是完整的，可用于后續實驗。用逆轉錄試劑盒產生cDNA。采用聚合酶鏈反應(RT-PCR)，以β-肌動蛋白為內參照基因，測量miR-146a的表達水平。RT-PCR條件包括35個循環:95 ℃變性30 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s。每個RT-PCR實驗至少重復3次取平均值。采用2-△△CT法計算miR-146a相對表達量。

2 結果

2.1 研究對象一般情況 本研究共納入376例患者，男267例(71.01%)，女109例(28.99%)。平均年齡(62.70±8.6)歲，63 例(16.76%)為AR患者。對患者一般資料進行比較，AR組中吸煙、高血壓、糖尿病的構成比顯著高于非AR組，AR組空腹血糖、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和miR-146a表達水平顯著高于非AR組，AR組高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)顯著低于非AR組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表1。

表1 兩組研究對象一般情況比較

2.2 血小板平均聚集率與各指標之間的相關性分析 對376例患者ADP誘導的血小板平均聚集率和AA誘導的血小板平均聚集率與其他指標進行Pearson直線相關分析。結果顯示，ADP誘導的血小板平均聚集率和AA誘導的血小板平均聚集率均與血糖、三酰甘油、LDL-C和miR-146a呈正相關(P<0.05)，與HDL-C呈負相關(P<0.05)，而與年齡、總膽固醇和血小板計數無關(P>0.05)，結果見表2。

2.3 ROC曲線分析 當miR-146a的cut-off值為4.17時，預測冠心病患者PCI術后發生AR的敏感度為93.2%，特異度為62.6%，曲線下面積為0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。結果見圖1。

2.4 多因素Logistic回歸分析 以測冠心病患者PCI術后發生AR為因變量，以表1中兩組差異有統計學意義的變量(吸煙、高血壓、糖尿病、血糖、三酰甘油、HDL-C、LDL-C、miR-146a)為自變量納入Logistic回歸方程，采用后退法。結果顯示,吸煙、高血壓、糖尿病、高血糖、高三酰甘油、低HDL-C、高LDL-C、高miR-146a是冠心病患者PCI術后發生AR的獨立危險因素(P<0.05)。結果見表3。

圖1 miR-146a預測冠心病患者PCI術后發生AR的ROC曲線

3 討論

PCI是冠心病患者最常用的治療方式。PCI主要通過冠狀動脈支架的植入從而實現血運重建的目的，目前已被廣泛應用于臨床[4]。近年研究顯示，支架本身可以激活血小板，引起支架內血小板聚集，導致支架內血栓形成，進而嚴重危及患者的生命安全[5]。目前，阿司匹林常用于冠心病患者PCI術后抗血小板治療且效果顯著。然而在治療的過程中，部分患者血小板活性并沒有被完全抑制，會出現阿司匹林抵抗，從而導致不良的臨床效果[6-7]。本研究檢測了376例經皮冠狀動脈介入治療冠心病患者的血小板聚集率。結果表明，AR的發生率為16.8%，與文獻報道一致[8]。

表2 血小板平均聚集率與各指標之間的相關性分析

表3 冠心病患者PCI術后發生AR多因素Logistic回歸分析

microRNA是短的非編碼RNA，在轉錄水平上抑制蛋白編碼基因的表達[9]。每一個microRNA可調節幾十到數百個與功能相關的靶基因。隨著對microRNA研究的不斷深入，越來越多的研究發現，microRNA與阿司匹林抵抗有一定的相關性。范雪松等[10]的研究發現，較低水平的尿miR-126與健康人AR發生風險增加顯著相關。王建麗[11]研究發現，血小板miR-200b和miR-495表達水平降低可增加急性腦梗死患者AR的發生風險。馬開富等[12]檢測了137例急性腦梗死患者血小板miR-19a的表達水平， 發現AR組患者血小板miR-19a的表達水平顯著高于非AR組患者。然而，尚沒有研究探索miR-146a與冠心病患者PCI術后發生AR的相關性。本研究納入在我院心內科接受PCI治療的冠心病患者376例，檢測其血清miR-146a的表達水平，并分析血清miR-146a的表達水平與AR的相關性，結果發現，miR-146a的表達水平上調可增加冠心病患者PCI術后發生AR的風險。目前，AR的發生機制尚不清楚，有學者認為關于其可能與非COX-1介導的血小板活化、藥代動力學、血小板反應性、藥物遺傳學等有關。王路橋等[13]的研究發現，miR-146a可能依賴血小板TLR-4信號通路，介導血小板免疫活化進而促進血小板聚集。Guo等[14]研究發現，miR-146a可促進Th1細胞的上調并促進炎癥反應，而炎癥反應又可促進AR的發生發展[15]。

此外，本研究采用ROC曲線計算了miR-146a對冠心病患者PCI術后發生AR的預測價值。結果發現，敏感度為93.2%，特異度為62.6%，曲線下面積為0.846(95%CI:0.805～0.881，P<0.05)。進一步證實了miR-146a對冠心病患者PCI術后發生AR具有一定的預測價值。

綜上所述，本研究發現血清miR-146a表達水平與冠心病患者PCI術后發生AR顯著相關，miR-146a表達水平上調可增加冠心病患者PCI術后發生AR的風險。