二甲雙胍通過PI3K-AKT-MDm2通路對PCOS患者子宮內膜的影響

邵 洋，楊婷婷，張 潔，強 萍

0 引言

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡婦女月經紊亂和不孕的最常見病因，臨床表現為持續無排卵、雄激素過多、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)[1]。調節PCOS激素內分泌紊亂是臨床上主要的治療原則。達英-35含醋酸環丙孕酮，可以抑制雄激素分泌與合成，臨床上常用于PCOS治療[2]。IR的調節在PCOS 治療過程中的作用越來越受到重視[3]，鹽酸二甲雙胍是臨床上常用的抗糖尿病藥物，可以增加組織細胞對胰島素的敏感性，臨床上鹽酸二甲雙胍聯合達英-35治療PCOS的報道較多[4-5]，本研究觀察了鹽酸二甲雙胍聯合達英-35治療PCOS對患者子宮內膜的影響，并探討了PI3K-AKT-MDm2通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集2016年2月至2019年1月我院診治的86例PCOS患者，PCOS診斷參照《中國PCOS診斷標準(2011年)》[6]。排除對象:伴發糖尿病、先天性腎上腺皮質增生、肝臟疾病或者惡性腫瘤者，曾服用影響胰島素敏感性或者激素類藥物者。使用數字法將患者隨機分為達英-35治療組(對照組)和二甲雙胍+達英-35治療組(觀察組)，每組43例。對照組年齡18～37歲，平均(28.16±5.24)歲，病程 11～46個月，平均(22.18±5.63)個月，月經初潮年齡12～15歲，平均(13.32±1.02)歲;觀察組年齡20～40歲，平均(28.42±5.35)歲，病程 10～45個月，平均(22.33±5.71)個月，月經初潮年齡11～15歲，平均(13.18±1.14)歲。兩組患者在年齡構成、病程長度、月經初潮年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。另外，選擇我院16例非PCOS患者正常子宮內膜組織(輸卵管因素不孕經前或卵巢良性腫瘤術前行診刮術者)作為非PCOS對照組，年齡20～39歲，平均(28.25±5.14)歲，月經初潮年齡12～16歲，平均(13.58±1.09)歲。PCOS患者與非PCOS對照組在年齡構成和月經初潮年齡方面差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究所有患者均通過我院倫理委員會審核，所有受試者均知曉本研究并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 對照組:于月經第5天起服用達英-35(德國先靈藥業，醋酸環丙孕酮2 mg、炔雌醇0.035 mg)1片/d，連服21 d為1個療程，共3個療程。觀察組:達英-35用藥同對照組，同時，餐前0.5 h嚼服二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，0.5 g)，250 mg/次，2次/d，連用3個療程。

1.3 臨床觀察指標 抽取PCOS患者靜脈血，交由檢驗科，使用電化學發光法測定治療前和療程結束后的卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)，使用葡萄糖氧化酶法測定空腹胰島素(FINS)、空腹血糖(FBG)，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR=FINS×FBG/22.5)。檢測試劑盒購自美國Sigma-aldrich公司。計算治療前后PCOS患者體重指數(BMI，kg/m2)。采用陰道超聲(TVB)測量治療前后PCOS患者卵巢體積以及子宮內膜厚度。

1.4 子宮內膜的免疫組化染色檢測 于閉經或陰道淋漓出血時行診刮取PCOS患者子宮內膜組織，福爾馬林固定后送病理科，石蠟包埋制作4 μm 組織樣本切片，PI3K、p-AKT、AKT、MDm2抗體購自美國cell signal公司，嚴格按照抗體說明書操作加入相關抗體(1∶100稀釋)，濕盒孵育過夜，加入生物素辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，顯示劑反應顯示后蘇木精復染。整個操作使用全自動IHC平臺Leica Bond-Max完成，棕色為陽性染色，染色評分=面積分數(陽性染色細胞比例)×染色強度(1=低強度，2=中強度，3=高強度染色)。

1.5 統計分析 使用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計量資料同個體治療前后比較采用配對t檢驗，計量資料組間兩兩比較采用獨立t檢驗，多組均數的比較采用方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組PCOS患者治療前后臨床指標的變化 治療前，兩組PCOS患者FSH、LH、T、HOMA-IR和BMI比較差異無統計學意義(P>0.05)，治療后，兩組FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI水平降低(P<0.05，P<0.01)，且觀察組低于對照組(P<0.05)，見表1。

2.2 兩組PCOS患者卵巢和子宮內膜的變化 治療前，兩組PCOS患者左右側卵巢體積和子宮內膜厚度比較差異無統計學意義(P>0.05)，治療后，兩組左右側卵巢體積和子宮內膜厚度均顯著減小(P<0.01)，且觀察組小于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3 二甲雙胍對PCOS患者子宮內膜PI3K-AKT-MDm2的影響 PCOS患者子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評分顯著高于非PCOS對照組(P<0.05，P<0.01)，對照組子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評分顯著高于觀察組(P<0.01)，見表3、圖1。

表1 兩組患者治療前后臨床指標比較

注:與治療前比較，*P<0.05，**P<0.01;與對照組比較，#P<0.05

3 討論

PCOS在育齡期女性中的患病率為7%～10%，患者以排卵功能障礙、多囊卵巢和高雄激素血癥為特征[7]，患者無法產生孕激素來平衡雌激素，在雌激素長期作用下，患者的子宮內膜受到影響，增生過多，甚至癌變[8]。有報道，40歲以下子宮內膜癌患者中約19%～25%伴發PCOS[9-10]。達英-35是炔雌醇和雄激素受體拮抗劑醋酸環丙孕酮組成的復方制劑，可以調節PCOS患者的激素異常，是臨床上首選治療藥物。然而，有研究顯示，單獨達英-35治療效果并不理想[11]。實驗結果顯示，胰島素抵抗在PCOS患者激素紊亂中的作用逐漸被發現[12-14]，因此，胰島素增敏劑開始受到臨床工作者的關注。二甲雙胍是常用的抗糖尿病藥物，可以增加組織細胞對胰島素的敏感性[15-16]。本研究顯示，治療后，觀察組患者FSH、LH、T、HOMA-IR、BMI均低于對照組，說明加用二甲雙胍拮抗胰島素抵抗后，患者的激素紊亂得到了有效糾正。進一步的卵巢體積和子宮內膜厚度檢查發現，治療后，觀察組卵巢體積和子宮內膜厚度均小于對照組，表明拮抗胰島素抵抗更有利于患者卵巢和子宮內膜的恢復。

表2 兩組患者治療前后卵巢體積和子宮內膜厚度比較

注:與治療前比較，**P<0.01;與對照組比較，#P<0.05

表3 三組患者子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白染色評分比較

注:與治療前比較，**P<0.01;與對照組比較，##P<0.01

圖1 三組患者子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白的免疫組化染色(200×)

磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路是機體內細胞增殖的重要通路，PI3K由催化亞基pl10 和抑制性調節亞基p85組成，生長信號激活時，2個亞基分離，激活亞基pl10的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，進一步磷酸化下游的Akt[17]。PI3K/Akt通路在孕婦的胰島素抵抗以及子宮內膜的增殖中發揮重要作用[18]。雙微體(Murine double minute2，MDm2)基因是PI3K/Akt下游的靶基因，MDm2的靶基因是P53，PI3K/AKT通路活化，會導致MDm2表達升高，引起p53快速降解，引起細胞的異常增殖[19]，因此，PI3K-AKT-MDm2通路在子宮內膜增殖以及子宮內膜癌的發生發展中都發揮了積極的作用。本研究以正常子宮內膜作為對照，發現PCOS患者子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表達顯著升高，表明 PCOS患者子宮內膜存在PI3K-AKT-MDm2通路的過度激活;觀察組PCOS患者子宮內膜PI3K、p-AKT、AKT、MDm2蛋白表達顯著低于對照組，表明二甲雙胍可以抑制PCOS患者PI3K-AKT-MDm2通路的激活，這可能是二甲雙胍抑制PCOS患者子宮內膜增殖的機制[20]。蘇椿淋等[21]研究顯示，達英-35聯合二甲雙胍治療PCOS合并子宮內膜不典型增生及早期子宮內膜樣腺癌，可以使患者子宮內膜病變完全轉化，二甲雙胍治療是否可以降低PCOS子宮內膜癌的發生率有待長期隨訪來揭示。

綜上所述，本研究顯示，二甲雙胍通過抑制PCOS患者子宮內膜PI3K-AKT-MDm2通路，抑制子宮內膜的增殖。