人參糖肽研究進展

俞 萍張慶賀,2陳長寶趙明月戰 宇杜連云

(1. 長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院，吉林 長春 130117；2. 長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117)

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC. A. Mey.)的干燥根和根莖。據《神農本草經》等古籍記載，人參自古就被作為食品與藥物來服用[1]，2012年衛生部將其正式列入藥食同源中藥[2]。人參性甘、微苦，微溫，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養血、安神益智等功效，主要用于治療體虛欲脫、脾虛食少、肺虛喘咳、津傷口渴、氣血虧虛、驚悸失眠、免疫力低下、糖尿病等癥狀[3-4]。其所含的化學成分主要有皂苷、多糖、多肽、蛋白質、糖肽、聚炔醇、揮發油、氨基酸、有機酸類等[5-7]，其中人參皂苷、多糖、多肽以及糖肽等為生物活性成分。近年來，肽類成分因其分子量小于蛋白質而具有較高的生物利用度，又因其多具有獨特的生物活性備受關注[8]，被廣泛應用于藥品、食品、保健食品及化妝品等領域。

文章擬綜述人參糖肽的制備方法、分離純化技術、檢測分析方法、臨床應用及藥理活性等內容，并展望其未來發展方向，旨在為人參糖肽的進一步研究提供依據。

1 簡介

糖蛋白是由Montreuil于1973年提出，是除核酸外，由蛋白質分子與一種或多種含有碳水化合物基團的物質組成的復合物[9-10]。糖肽(glycopeptides)是指糖蛋白和蛋白聚糖中，糖與氨基酸或多肽鏈以共價鍵相連而形成的區域[11]，且糖肽在食品中常用于制作酒類，如張奎昌等[12-13]發明了一種銀杏糖肽酒的生產方法和一種富含大蒜糖肽的大蒜保健酒及其加工方法。人參糖肽(ginseng glycopeptides，GGP)相對分子質量為200～50 000 Da，其糖部分主要由甘露糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰半乳糖胺組成；其肽部分主要由17種氨基酸組成，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等[14-15]；具有降血糖、降血脂、降膽固醇、增強學習記憶能力、保護神經細胞、抗炎鎮痛等功能活性[14，16-17]。

2 提取與分離

2.1 提取

糖肽類成分的提取方法主要包括水提醇沉法、醇提水沉法以及透析法等。楊明等[18]采用分級沉淀法得到人參糖肽粗提物后，將其用蒸餾水溶解，于0～3 ℃冰箱中冷凍放置24 h，過濾，除去不溶物，濾液中加入粉末活性碳脫色，攪拌，靜置，濾去雜質，濃縮干燥，即可得到白色或微黃色精制的人參糖肽。王穎等[19-20]先采用透析法得到制備低相對分子質量人參糖肽的工藝，而后通過響應面法篩選制備低分子質量人參糖肽的最佳透析工藝：超濾液透析前其配制質量濃度為0.6 g/mL，透析時間為301.8 min，透析外液用水量為3.92 L，此條件下總糖肽量為人參水提物的79.26%。羅浩銘等[21]通過醇提水沉與超濾法相結合，將超濾后的分離液濃縮并凍干，得到收率為原藥材7%的人參非皂苷部分，再采用先煎煮后過D101大孔吸附樹脂洗脫、超濾、透析法得到人參糖蛋白[22]，其收率為人參藥材的0.45%。綜上，水醇法是人參糖肽的主要提取方法，為得到小分子人參糖肽，常與透析法聯合應用，該方法提取工藝簡單、經濟、安全，適用于工業化大生產，尤其適用于食品或保健食品的開發。但其提取效果并不理想，采用新方法、新手段以提高人參糖肽提取率的最佳提取工藝仍有待進一步研究。

2.2 分離

南敏倫等[23]使用DEAE-Sepharose CL-6B離子交換柱分離人參糖肽，并依次用0.2，0.5，1.0 mol/L的NaCl水溶液洗脫，再用Sephadex G-150、G-100柱分離純化，采用0.2 mol/L的NaCl水溶液洗脫可得到PGP-II，且PGP-II為主要的降血脂活性組分，其相對分子質量為6 000，其中糖部分由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖及葡萄糖4種單糖構成，物質的量為n(Rha)∶n(Ara)∶n(Gal)∶n(G1c)=0.46∶1.61∶1.00∶2.37。楊明等[18]使用Sephadex G-100凝膠層析、醋酸纖維薄膜電泳、Con-A-Sepharose 4B、親和層析證明了PGP-II為均一糖肽而不是糖和肽的混合物；甲基化分析表明，其糖肽中單糖的連接方式主要是(1→4)Glc、(1→4)、(1→6)Gal，(1→4或5)Ara，Ara和Glc為主要末端，Glc的6位，Gal的4或6位，Gal的(1→4)應該為分枝點；氨基酸分析表明，PGP-II肽部分由天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Fhr)、谷氨酸(Ser)、甘氨酸(Glu)等16種氨基酸組成。人參糖肽類成分由于其結構中糖和氨基酸的個數與種類不同，導致其化合物的分子量有較大差別，因此其分離手段主要是根據化合物的分子量不同而采用凝膠柱層析法，該方法具有操作簡便，分離效果較好，重復性高等特點。有關人參糖肽的分離純化的研究較少，且其分離純化方法的研究不夠深入全面，還有待改善。

3 檢測與分析

3.1 含量檢測

人參糖肽含量檢測主要是以其中性糖、酸性糖及蛋白質含量為指標。苯酚—硫酸法常被用來測定中性糖含量[24-25]，以葡萄糖為標準品；間羥基聯苯法常被用來測定酸性糖含量[26-27]，以半乳糖醛酸為標準品；Lowry法常被用來測定蛋白含量[28-29]，多以牛血清蛋白為標準品。

3.2 分子量分布測定

人參糖肽分子量測定常采用高效液相色譜法，該方法操作簡便，靈敏度高，重現性好，分離度高，對質量控制具有重要意義。王穎等[30]使用高效液相凝膠色譜分析系統，以葡聚糖Dextran T系列為標準品制作標準曲線，利用GPC軟件計算人參糖肽PG-g分子量分布；其選用OHpakSB-802(8.0 mm×300 mm)凝膠分析柱，以0.7% Na2SO4為流動相，柱溫35 ℃，流速0.5 mL/min，此時人參糖肽PG-g是分子量為1 305 Da和581 Da左右的兩種糖肽的混合物。王穎等[31]采用高效液相色譜法(HPLC)，以L-色氨酸、蛋白酶抑制劑、VB12、細胞色素C和牛血清白蛋白為對照品制作標準曲線，以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相，柱溫為室溫，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL條件下，人參糖蛋白顯示出多個峰，其分子量分布為1～40 kU，平均分子量為17 731 U。羅浩銘等[21]運用HPLC，以相對分子質量為1 000，3 000，5 000，12 000，25 000的葡聚糖與葡萄糖標準品制作標準曲線，選用Sepax SRT SEC-100(Φ7.8 mm×300 mm，5 μm)色譜柱，柱溫35 ℃，以pH 7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相，流速0.5 mL/min，測得人參非皂苷分子量為200～50 000 Da。

4 結構鑒定

4.1 糖類型

羅浩銘等[22]通過HPLC法分析人參糖蛋白組成糖，將樣品制備成PMP衍生物，以PMP衍生物的各單糖為對照品，選用Diamonsil-C18分析柱(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以流動相A為磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)與乙腈體積比85∶15、流動相B為磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)與乙腈體積比60∶40，流速0.9 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長250 nm，進樣量10 μL，得到的人參糖蛋白組成糖主要含有甘露糖(Man)、半乳糖(GalA)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰葡萄糖或N-乙酰半乳糖(GlcNAc或GalNAc)。

4.2 糖結構

王穎等[30]通過將人參糖肽PG-g制備成甲基化衍生物，將甲基化產物加入氫化鋁鋰的四氫呋喃溶液中，80 ℃反應16 h，然后加入稀鹽酸至無氣泡產生，離心取上層，吹干后二次甲基化，經水解、還原和乙酰化并進行GC-MS分離鑒定，結果顯示GlcA和GalA為PG-g的非還原末端，其中以GlcA為非還原末端的較多，以(1→3)-連接的GalA和(1→6)-連接的GlcA為主鏈，(1→3)-連接的GalA含量高于(1→6)-連接的GlcA，同時在部分GlcA的C3位與少量GalA的C6位存在分支點，而Ara以(1→2，4)-連接方式存在于主鏈與支鏈中。

4.3 氨基酸種類

王穎等[31]將20 mg人參糖蛋白加至6 mol/L HCl中，并充入氮氣封口，于110 ℃烘箱內水解22 h，冷卻，搖勻，過濾，雙蒸水定容至50 mL，取1 mL凍干后加入0.02 mol/L HC1搖勻，14 000 r/min離心15 min，吸取0.8 mL 上清液過0.45 μm濾膜，選用9 Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm)色譜柱，柱溫為室溫，以乙腈—水(55∶45，體積比)∶KH2PO4緩沖液(pH 7.2)=30∶70(體積比)為流動相，通過紫外檢測器檢測，檢測波長254 nm，流速1 mL/min，結果顯示，其肽部分主要由甘氨酸、半胱氨酸與蘇氨酸等17種氨基酸組成。

5 功能活性

5.1 降血糖

人參糖肽在臨床使用中可明顯降低2型糖尿(T2DM)患者的血糖，雖起效比較緩慢，但效果持久，即使停止服用后，血糖在一段時間內仍處于一個較低的水平[32]。人參糖肽注射液已作為國家級治療糖尿病(DM)的中藥二類新藥[33]應用于臨床，其對體外糖基化有明顯抑制作用，可用于消渴病、慢性并發癥的預防和治療，且具有補氣、生津和止渴的功效[34]，并能增加機體免疫力和修復胰島的功能[35]。Wang等[36]闡明了人參糖肽的降血糖機制，人參糖肽為β-受體激動劑，通過第二信使cAMP將信息傳輸至線粒體和細胞質，線粒體CST、MDH、SDH和CCO活性增加，導致糖有氧氧化過程改進和血糖水平下降，降低的血糖由PP活性升高導致的加速肝糖元分解來補充。劉雪梅等[37]通過建立2型糖尿病大鼠模型，采用高脂飼料喂養4周后再腹腔注射STZ的研究方法，表明STZ糖尿病小鼠受人參糖肽的影響血糖明顯下降，糖脂代謝得到改善，抑制胰島素抵抗和多種并發癥，人參糖肽結合耐力運動對STZ糖尿病大鼠的效果優于純人參糖肽和耐力運動。陳文學等[17]建立了2型糖尿病氣陰兩虛模型，將過量的青皮和附子顆粒通過灌胃給予糖尿病大鼠，結果顯示人參糖肽可使糖尿病氣陰兩虛大鼠血糖水平顯著下降。趙麗艷等[38-39]通過免疫組化法證實了人參糖肽對STZ引起的大鼠體外胰島β細胞損傷有防護作用。綜上，目前對人參糖肽的降血糖機制與作用研究比較深入，其良好的降血糖作用為糖尿病的治療提供了新思路和新方向。

5.2 降血脂作用

劉雪梅等[40]通過建立高脂血癥大鼠模型的方法研究了人參糖肽的降血脂作用，結果表明，耐力運動組、純注射人參糖肽組與人參糖肽結合耐力運動組大鼠的TG、TC、LDL-C、ApoB、MDA顯著低于高脂模型對照組，而HDL-C、ApoA1、SOD水平顯著偏高；與耐力運動組相比，純注射人參糖肽組TC水平顯著偏低，SOD水平顯著偏高，而其他指標無明顯變化，人參糖肽結合耐力運動組TG、TC、LDL-C、ApoB及MDA水平顯著偏低，HDL-C、SOD和GSH水平顯著偏高；與純注射人參糖肽組相比，人參糖肽結合耐力運動組TG、LDL-C、ApoB及MDA水平顯著偏低，SOD、GSH顯著偏高，而其他指標無明顯變化；純注射人參糖肽和單純耐力運動可降低大鼠血脂水平，具有良好調節機體脂質代謝紊亂的作用；人參糖肽結合耐力運動對高脂血癥大鼠的降脂作用效果優于單純給予人參糖肽與單純耐力運動。上述結果表明，人參糖肽降血脂作用的研究不夠深入全面，且其作用機制均未見報道，后續可在相關方面進行深入研究。

5.3 抗炎和鎮痛作用

田建明等[41]采用角叉菜膠及甲醛誘發大鼠炎癥疼痛模型的研究方法，發現人參糖肽具有抗炎和鎮痛效果；當角叉菜膠致炎后6 h，15，30，60 mg/kg的人參糖肽具有明顯降低大鼠足腫脹度、炎癥足組織丙二醛的效果；30，60 mg/kg 的人參糖肽具有明顯降低該模型大鼠血清IL-1，IL-2，IL-4，TNF-α，組胺的效果；人參糖肽對甲醛致痛Ⅰ相(1～5 min)疼痛評分值基本無影響；15，30，60 mg/kg 的人參糖肽對疼痛模型大鼠腦組織5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素、谷氨酸和γ-氨基丁酸等基本無影響，但其具有顯著抑制Ⅱ相(31～35 min)疼痛評分值的效果。說明人參糖肽雖具抗炎和鎮痛效果，但其具體作用機制依舊不詳，還有待進一步研究。

5.4 神經細胞保護作用

胡婧婷等[14]通過Aβ25-35處理的PC12細胞凋亡模型的方法，研究人參糖肽對神經細胞的作用；當在PC12細胞中加入人參糖肽后，細胞存活率明顯提高，凋亡率與S期細胞百分比顯著降低；當人參糖肽濃度為1 g/L時，細胞存活率最高可達121.07%，最低為108.61%。說明人參糖肽可減慢凋亡速度，具有神經細胞保護作用，但其作用機制還有待考究。

5.5 其他作用

人參糖肽除了具有降血糖、降血脂、抗炎鎮痛、保護神經細胞的功能活性外，還具有增強學習記憶能力[21]、抗凋亡[42]、改善膠原交聯[43]等藥理作用。Li等[43]通過觀察人參糖肽對大鼠尾腱膠原交聯體內外的影響情況，發現尾腱膠原在人參糖肽的影響下，其溶解性明顯增加。

6 結束語

目前，人參糖肽的研究主要集中于提取、分離、含量測定和功能活性等方面，但其提取方法較為單一、提取率低，且有關其分離純化的研究相對很少，尤其是工業化的提取和純化；由于人參糖肽結構的復雜性，其高級結構的鑒定研究有待提高；生物活性方面，其毒理學及臨床試驗也需逐漸開展，以及人參糖肽的構效關系研究也需進一步開展。