脫細胞外基質(zhì)支架材料在骨再生中的應用及研究進展

張艷珉，姜治偉，楊國利，王慧明

腫瘤、創(chuàng)傷、發(fā)育畸形、感染等原因造成骨缺損的快速而功能性修復一直是臨床醫(yī)生們的追求。近年來，骨缺損修復材料不斷更新與發(fā)展，自體骨移植一直被視為“金標準”，開辟第二術區(qū)和取骨量不足的問題使得臨床的普及應用受限制,異體骨因免疫排斥問題臨床普及應用也受限制；隨著生物材料學的不斷進步，人工合成材料和生物活性材料的出現(xiàn)擴大了骨缺損修復的應用范圍，取得了良好的修復效果，代表性的材料有：生物活性玻璃材料、聚合支架材料、鈣磷為基礎的生物活性陶瓷支架材料、復合支架材料、金屬材料，但是這些材料也存在著一些問題，如生物活性降低、生物相容性差、支架降解等、并不能提供骨再生過程中穩(wěn)定的微環(huán)境[1]。理想的骨缺損修復材料應滿足以下關鍵因素：種子細胞的募集、緩釋生長因子及提供一個穩(wěn)定的模擬微環(huán)境的生物活性支架。隨著組織工程的不斷發(fā)展，脫細胞外基質(zhì)(dECM)材料因促進種子細胞的粘附、增殖、調(diào)控成骨分化、維持干性、挽救衰老干細胞活性、血管生成作用、富含豐富的生長因子等優(yōu)點逐漸受到學者們研究和關注，脫細胞外基質(zhì)材料按照其來源可分為細胞來源的脫細胞外基質(zhì)材料和組織、器官來源的脫細胞外基質(zhì)材料，細胞來源的脫細胞外基質(zhì)因細胞來源廣泛，大量擴增，種類豐富而備受學者們關注，本文僅圍繞細胞來源的脫細胞外基質(zhì)材料在骨再生中應用及研究進展做一綜述。

1 dECM的成分及制備原理

dECM材料不僅具有組織特異性，而且成分結構處于動態(tài)變化之中,是由多種蛋白成分、生長因子、對細胞生理功能發(fā)揮重要作用的小分子物質(zhì)組成的錯綜復雜的結構[2]。蛋白成分主要由膠原、彈性蛋白、硫酸軟骨素等結構蛋白以及纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和韌粘素等粘結蛋白組成,此外，還有豐富的堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblastic growth factor , bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)和肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等生長因子[3-5]。

脫細胞處理最關鍵的是去除具有免疫源性細胞成分和細胞核成分的同時保持dECM結構的完整性。目前，常用制備dECM的方法主要有三種：生物化學處理(Triton X-100、SDS等有機溶劑去除細胞成分,DNA酶和RNA酶等生物酶類去除細胞核成分)、物理方法處理(反復凍融、機械震蕩)、化學處理(SDS等有機溶劑去除細胞和細胞核[6-8])。應根據(jù)特定細胞類型、細胞密度、細胞外基質(zhì)厚度和細胞厚度選擇有效的脫細胞方法[9]。目前有研究針對組織制定了脫細胞的參考標準：HE染色，DAPI染色觀察不到細胞核；每毫克干燥組織DNA定量少于50 ng；DNA 片段大小在200 bp以下[10]。但是針對細胞來源的dECM脫細胞尚無一致的標準。目前的大多數(shù)研究思路是脫細胞處理后通過細胞骨架染色、DAPI染色、DNA含量這三個參數(shù)評估脫細胞是否相對徹底,通過I型膠原定性定量評估dECM的結構是否相對完整[11-12]。

2 dECM的生物學性能及作用

2.1 dECM維持種子細胞干性，調(diào)控成骨分化

有研究表明，人類骨髓間充質(zhì)干細胞來源的細胞外基質(zhì)能維持大鼠脂肪干細胞的干性，包括自我更新多向分化潛能及細胞增殖能力,促進脂肪干細胞的成骨分化[13-14]。細胞膜片經(jīng)脫細胞處理后形成dECM片層定植在鈦片上，該dECM片層與鈦片復合體能夠調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)的形態(tài)、增殖和成骨分化[15]。此外，年輕間充質(zhì)干細胞來源的dECM能夠挽救衰老干細胞的復制和成骨能力[16]。

2.2 dECM促進種子細胞粘附、增殖

與I型膠原相比，接種在人類間充質(zhì)干細胞來源的生物活性dECM表面的種子細胞具有明顯的增殖、粘附、遷移和多向分化潛能[17]。更為重要的是，dECM中含有豐富的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)等內(nèi)源性生長因子，尤其是BMP-2、IGF對成骨分化是極為有利的[18]。

2.3 dECM提供種子細胞營養(yǎng)與活力的微環(huán)境

dECM由于大量的Ⅰ型膠原成分在細胞凍存中保持種子細胞的生命活力發(fā)揮了重要生物功能[19]。值得關注的是，內(nèi)源性dECM不僅能顯著促進3D細胞聚合體的形成，而且還能維持缺氧環(huán)境下3D細胞聚合體中細胞的活力、增殖與多向分化潛能[20]。骨缺損修復中血管化生成為骨再生提供了血供來源、運輸營養(yǎng)、排泄代謝物等微環(huán)境。血管化功能骨也因此倍受學者關注，相關研究發(fā)現(xiàn)細胞來源的dECM不僅對影響人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞的血管形態(tài)至關重要，而且還提供了一個促進人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞血管生成的微環(huán)境[21]。基于此，dECM作為一種具有生物活性的天然材料在骨再生中得到了廣泛應用與研究。

3 dECM材料在骨再生中的應用及優(yōu)缺點

3.1 dECM蛋白成分與合成支架材料涂層

dECM可以制備成均質(zhì)混勻的dECM溶液，然后涂層在生物支架材料表面例如PLGA/PLA網(wǎng)狀支架、BG/PLG復合支架，并進行干燥滅菌處理，體內(nèi)體外實驗均證明這種dECM蛋白分子涂層復合支架能促進細胞粘附和成骨效應[22-23]。盡管dECM蛋白成分與支架材料形成復合涂層具備良好的成骨效應，但是dECM的三維微觀結構會遭到破壞，而且并不能模擬天然細胞外基質(zhì)(ECM)復雜的活性成分，僅僅是局限于某種生物活性成分發(fā)揮的成骨效應，成骨效應的潛能有待進一步發(fā)掘。

3.2 將粘附在生物材料表面的細胞進行脫細胞處理

有研究在3D打印PCL/PLGA支架表面接細胞，利用旋轉生物反應器進行3D細胞培養(yǎng)形成有效的營養(yǎng)供應以促進細胞外基質(zhì)的形成，最后脫細胞處理接種細胞的3D打印支架，形成一個ECM涂層的3D打印支架，體內(nèi)體外實驗證明該支架具有良好的成骨能力[24]。盡管細胞來源的dECM涂層在支架材料上最大可能地模擬了骨組織再生的三維微環(huán)境，但是有研究認為直接將細胞培養(yǎng)在特定材料表面并不適用于各種各樣的材料表面[15]，該方法在一定程度上限制了材料的應用。最重要的是，脫細胞處理是否會影響外源性支架與dECM界面處的穩(wěn)定性，有待深入研究。

3.3 脫細胞膜片來源的dECM片層與生物相容性材料復合

有研究通過多巴胺化學技術使脫細胞膜片形成的dECM片層與鈦片復合，形成了在純鈦表面涂層細胞膜片來源的dECM片層，深度解析了表面微形貌、纖維排列和成分，體外研究發(fā)現(xiàn)，該涂層促進骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和成骨分化[15]。脫細胞膜片來源的dECM片層很大程度上保留了dECM的纖維排列結構和微觀形貌及生物活性成分，尤其是保存dECM片層的結構完整性和大約相當于10%的新鮮細胞膜片生長因子的含量[4]。但是與外源性支架的復合是否因為外源性支架的存在可能掩蓋了成骨效應的發(fā)揮有待進一步深入研究。

3.4 無外源性支架材料dECM的應用

有研究將成骨誘導后的骨髓間充質(zhì)干細胞膜片經(jīng)脫細胞處理后形成成骨誘導后的脫細胞外基質(zhì)片層，含有大量的膠原成分及生長因子(BMP-2, VFGFs, TGF-β1, bFGF),并且具有骨誘導和骨傳導特性，能顯著促進大鼠股骨節(jié)段性骨缺損的修復[25]。最近一項研究將人類間充質(zhì)干細胞膜片來源的脫細胞外基質(zhì)接種軟骨細胞，體外研究發(fā)現(xiàn)該支架能明顯促進軟骨細胞的增殖和提高軟骨細胞表型。動物實驗證實，將其接上軟骨細胞后折疊形成3D結構，該結構能顯著促進軟骨再生[26]。盡管這種純粹生物活性dECM支架的應用首先解決了外源性人工合成支架降解帶來的系列問題，但是細胞來源的dECM支架可能存在著結構的不足和形狀的不穩(wěn)等問題。總之，不同應用形式的dECM支架存在著不同程度的優(yōu)缺點，正是這些不同層面的缺陷推動著科研人員的認知不斷進步，伴隨著材料學、生物力學等學科的不斷進步與發(fā)展，dECM在骨再生中應用中相關機理和應用形式有待深入研究與改進。

4 dECM在骨再生中的作用機理

4.1 生物活性成分發(fā)揮了重要的骨再生效應

生物活性成分例如纖連蛋白(fibronectin, FN)、Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ)、硫酸軟骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)發(fā)揮了舉足輕重的骨再生效應 dECM的一個主要生物活性分子FN具有抑制破骨效應，可能的機理與抑制NF- κB信號通路和降低細胞內(nèi)活性氧(ROS)有關[27]，此外，dECM尤其是Ⅰ型膠原可以提高間充質(zhì)細胞內(nèi)抗氧化酶水平，通過激活SIRT1依賴的信號通路提高間充質(zhì)干細胞抵抗對氧化應激引起的細胞早衰[28]。在炎癥狀態(tài)中，Ⅰ型膠原可通過OSCAR介導的信號通路促進單核細胞來源的樹突狀細胞的成熟[29]。硫酸軟骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)在促進成骨細胞分化的同時通過上調(diào)OPG的表達來抑制破骨細胞分化[30]。dECM還可以通過ROCK Ⅱ通路增加肌動蛋白細胞骨架的張力來延續(xù)已分化間充質(zhì)干細胞的成骨表型[31]。

4.2 生物活性分子的物理排列與表面微形貌對干細胞行為調(diào)控促進骨再生

亦有研究通過表征方面分析不同細胞來源的dECM的特殊蛋白的物理排列來解釋不同的生物學效應[5]。表征分析研究發(fā)現(xiàn)：與軟骨細胞來源的dECM相比，成纖維細胞來源的dECM中FN呈現(xiàn)空間緊密而又有序的排列，這種特定蛋白有序的物理排列，使得成纖維細胞來源的dECM能夠明顯上調(diào)成骨相關蛋白：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase ,ALP),骨橋蛋白(osteopontin , OPN),骨鈣素(osteocalcin, OCN)和Col-I，從而發(fā)揮dECM成骨生物學效應。改變dECM彈性模量和表面形貌通過激活FAK/RhoA/ROCK/MAPK信號軸調(diào)控干細胞行為[32]。dECM表面微形貌調(diào)控成骨分化的復雜機理也可能涉及Hippo信號通路中的兩個蛋白成員：YAP和TAZ，細胞對dECM納米拓撲結構的反應跟YAP和TAZ有關[33]。TAP和TAZ通過調(diào)控骨形成、改建和骨基質(zhì)的機械屬性發(fā)揮聯(lián)合效應促進成骨[34]。目前關于dECM與TAP/TAZ之間的聯(lián)系鮮有報道，相關機理需進一步深入研究。

4.3 dECM含有大量內(nèi)源性生長因子

dECM為骨再生提供了含有豐富內(nèi)源性生長因子的微環(huán)境，并且持續(xù)緩慢釋放IGF-1等生長因子促進種子細胞的增殖和成骨分化[18]；而且由生物活性分子組成的三維空間結構的dECM可能又會更多的募集籠絡緩釋大量生長因子。

4.4 整合素介導的細胞與dECM之間的信息傳遞調(diào)控細胞的行為

整合素介導細胞在dECM上的粘附和遷移，整合素還能感知張力、空間構像及ECM組成的變化，在細胞與ECM之間起到雙向信息傳遞作用，這種信息轉換取決于整合素相關因子包括整合素類型、集群等[35]；不僅如此，整合素對細胞最初粘附到生物材料表面也起到重要作用[36]。有研究[37]發(fā)現(xiàn)預處理脫細胞支架表面，使支架表面含有特定粘附蛋白，能顯著提高表達整合素α3β1，α6β1和α5β1的細胞對支架的再粘附能力，闡明了細胞表面整合素與dECM特定蛋白匹配對放大細胞生物學效應的重要作用。此外，整合素可通過Wnt信號通路調(diào)控細胞的分化，Wnt5a 提高整合素mRNA和蛋白的表達，進一步調(diào)控間充質(zhì)干細胞的成骨分化[38]。ECM也可通過integrinα5、Akt、GSK-3β通路調(diào)控間充質(zhì)干細胞成骨分化[39]。總之，dECM在骨再生中涉及到的機理極其復雜多樣，不斷深層次挖掘和認識dECM在骨再生中的機理，進一步優(yōu)化dECM生物相容性材料，才能實現(xiàn)由基礎研究到臨床應用的轉化。

5 細胞來源dECM的未來發(fā)展趨勢

細胞來源的dECM材料在骨組織工程中的應用不僅實現(xiàn)了干細胞的“回收利用”，而且還制備了一種新型具有生物活性天然支架材料的雛形。但是，有研究報道徹底的脫細胞與相對不完全脫細胞處理，dECM生物活性并沒有明顯區(qū)別，過度脫細胞處理會削弱ECM的生物學功能[40]。因此針對更為有效和微創(chuàng)的脫細胞方法可能是未來的一個研究趨勢。細胞來源的dECM結構纖維薄而脆弱，在不依賴外源性支架材料直接組裝形成3D微結構的同時，膠原纖維結構容易破壞，因此，針對提升dECM膠原纖維結構強度的研究可能是未來的一個趨勢。常規(guī)制備dECM生物活性材料無法實現(xiàn)個性化與精準化骨缺損修復，3D打印技術在生物材料中的應用實現(xiàn)了個性化與精準化的需求，因此，利用3D打印技術實現(xiàn)個性化與精準化dECM材料的制備有可能是未來骨缺損修復材料發(fā)展的趨勢。