自噬在創面愈合中的作用研究進展

冷敏 彭穎 林曉瑩 汪虹

昆明醫科大學第二附屬醫院燒傷科（昆明650188）

創面愈合是涉及一系列復雜生物學行為的動態過程，分為4個伴隨和重疊的階段：炎癥、血管再生、再上皮化與膠原蛋白沉積［1］。既往研究［2］表明，多種細胞及細胞因子在創面愈合中起著重要作用，目前已有研究證實自噬參與調控間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治療創面修復相關［3］，但事實上，自噬除了參與調控MSCs功能之外，也在調控創面愈合各個階段相關細胞的功能中發揮重要作用。自噬（autophagy）是溶酶體與細胞內成分（細胞器、蛋白質等）融合、降解，最終實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器更新的過程。研究顯示［4-5］，自噬參與了多種細胞功能的調控，并與多種疾病發生發展密切相關，包括癌癥、衰老、創傷等，已成為當今基礎生命科學和醫學研究的熱點之一。現本文通過查閱國內外最新文獻，旨在總結自噬在創面愈合中的相關作用機制，以期為今后進一步通過調控自噬從而改善創面愈合提供理論依據及實踐基礎。

1 自噬的分類及作用過程

目前普遍認為自噬主要以三種形式存在——伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬——其主要區別在于它們的生理功能和向溶酶體的傳遞方式不同［6］。其中巨自噬是自噬中研究最廣泛的形式，巨自噬（以下簡稱自噬）指對細胞內蛋白質和核酸以及細胞質、部分細胞器和細胞膜等成分的降解過程［7］。當前研究表明，自噬主要有兩種類型——非選擇性自噬和選擇性自噬，非選擇性自噬是指位于自噬小體形成位點的細胞質成分被隨機分配到自噬體中；相反，在選擇性自噬過程中，某些分子、結構和細胞器被稱為“自噬受體”的特殊蛋白質所識別和吞噬，細胞根據自身狀態利用這些不同類型的自噬來維持自身的穩態或調節其功能［8-10］。

完整的自噬過程被描述為自噬通量，包括自噬體的形成，自噬體與溶酶體的融合，以及溶酶體中物質的降解［11］。相關研究表明自噬通常由一種稱為ULK多蛋白復合物介導啟動的，ULK1與ATG13、ATG101以及FIP200相互作用，形成ULK復合物［12］，它在細胞內起著應激和營養傳感器的作用［13］。該復合物是自噬的關鍵啟動因子，其活性主要通過mTORC1和AMP活化蛋白激酶（AMPK）在不同位點磷酸化來調控，最終將細胞內容物轉移到溶酶體的雙膜小泡進行降解［14-15］。ULK復合物激活觸發Ⅲ類PI3K復合物Ⅰ（PI3KC3）上的多個蛋白磷酸化，包VPS34、Beclin?1、LC3、VSA15和Atg14等，這些蛋白的磷酸化激活PI3KC3信號通路［16］。其中LC3蛋白在Atg4半胱氨酸蛋白酶作用下形成LC3 I，再與PE結合形成自噬體膜的主要成分LC3 II［17］。

2 自噬與創面愈合

2.1 自噬可改善創面炎癥炎癥期是創面損傷后的第一個階段，炎性細胞大量活化，導致炎性細胞因子失控釋放，進而導致創面炎癥反應，而促進自噬可抑制炎性細胞因子的生成，有助于炎癥的消退，而減少炎癥對于預防組織損傷和隨后的纖維化至關重要［18］。例如，有報道稱自噬相關蛋白的缺乏會誘導炎性小體異常激活，從而導致嚴重的組織損傷，相反自噬誘導劑可通過調控自噬相關蛋白顯著改善了炎性體相關疾病的癥狀［19］。而胸腺素β4（Tβ4）是已知的具有抗炎活性的物質，相關研究表明胸腺素β4（Tβ4）抗炎活性主要通過誘導自噬發生，可促進傷口的愈合。RENGA等［20］發現Tβ4可通過激活LAP/DAPK1信號途徑，下調NF?κB，明顯降低炎性細胞因子（如TNF?α），進而抑制炎癥的發生。這就提示通過Tβ4增強自噬活性是抑制炎癥的潛在方法。此外，最近CHIU等［21］在用遠紅外（FIR）治療深Ⅱ度燒傷大鼠模型的研究中發現，FIR不僅增加了巨噬細胞中自噬小泡的形成，且誘導了LC3?II，Beclin?1的表達的增加，進而激活自噬，最終抑制了NLRP3炎性體的形成并減少了IL?1β的分泌；另一方面FIR也可誘導ASC的泛素化，并限制NLRP3炎性體的活性，從而增加創面愈合率。總之，Tβ4和FIR兩者都可通過調控自噬，減少炎癥期相關炎癥因子產生，進而減輕炎癥。

2.2 自噬可誘導創面血管生成創面損傷常常伴隨著血管缺損，造成創面缺氧和隨后ROS積累導致的氧化應激，最近有研究表明，缺氧可激活自噬相關蛋白，從而刺激ECs增殖和分化，并誘導血管生成［22］。有研究人員用紅景天苷處理被過氧化氫損害的人臍靜脈內皮細胞，結果顯示紅景天苷可通過激活AMPK促進自噬相關蛋白Beclin?1，LC3?II/LC3?I表達明顯上升，且細胞凋亡減少，細胞活力的顯著提高［23］。提示紅景天苷誘導自噬可能通過調節ECs的適應性來保護細胞免受氧化應激損傷，進而提升ECs活力，為紅景天苷作用于創面血管再生打下基礎。ERK是一種泛素激酶，ERK信號通路在VEGF旁分泌中起重要作用。有研究發現，對C57小鼠進行全層皮切除，同時局部注射雷帕霉素（自噬激動劑）干預的MSCs，誘導LC3?II表達可通過MAPK/ERK1/2信號通路刺激MSCs中VEGF旁分泌，促進ECs形成，有助于創面血管再生［24］。說明自噬可激活ERK信號通路上調VEGF的表達，為自噬調節MSCs治療作用提供了新見解。

2.3 自噬有助于創面再上皮化創面再上皮化是角質形成細胞從基底層向角質層遷移并同時發生增殖與分化的過程。因創面血管破裂及傷口邊緣的耗氧量增加，角質形成細胞遷移多在缺氧環境中進行［25］。研究證明，由缺氧環境介導的ROS積累可觸發角質形成細胞中p38和JNK MAPK的激活，進而上調了BNIP3誘導的自噬，并導致LC3、Atg5、Beclin?1等的表達明顯增加，促進表皮角質形成細胞遷移［26］。但缺氧導致過量ROS的積累對傷口修復是不利的，而瑞芬太尼可減少ROS的產生。近期KIM等［27］通過對比瑞芬太尼預處理過氧化氫組、過氧化氫組、3?MA（自噬抑制劑）+瑞芬太尼預處理過氧化氫組人角質形成細胞，結果顯示瑞芬太尼預處理過氧化氫組的Atg5，Beclin?1，LC3?II表達明顯上升，且該組人角質形成細胞自噬體也顯著增多，而凋亡相對減少，同時增加了細胞遷移。該研究不僅證明瑞芬太尼預處理可改善過氧化物誘導的人類角質形成細胞的氧化損傷，而且還證明了瑞芬太尼的抗氧化作用是通過自噬介導的，自噬激活可以抗氧化損害，幫助創面再上皮化。此外，有研究證實角蛋白對再上皮化形成也至關重要，如李雄等［28］在研究中發現在深Ⅱ度燙傷動物模型中，用暴露燒傷療法（MEBT）/濕潤燒傷膏（MEBO）均勻涂抹創面，可通過上調自噬相關蛋白Beclin?1，LC3，使角蛋白19的表達升高，進而促進創面再上皮化。

此外，有學者［29］發現皮膚電場變化也激活自噬，參與了創面愈合過程。完整皮膚中存在跨上皮電勢差（trans?epithelial potential，TEP），但是在創面形成后，TEP會立即消失，同時產生內源性傷口電場（EF），即創面內部帶有負電被稱為陰極，傷口周圍完好組織帶正電被稱為陽極，以便細胞向傷口中心定向遷移［30］。有學者證實，磷酸酶和張力同源物（PTEN）和PI3K是感應EF的關鍵因子，其中PTEN又是PI3K的負性調控因子，已有研究發現EF通過下調PTEN激活PI3K信號通路中的mTORC1的活性，并誘導LC3?II的表達增加，進而誘導自噬激活，加快角質形成細胞產生上皮?間充質轉換（epithelial?to?mesenchymal transition，EMT）和定向遷移速度［31］；此外，YAN等［32］學者發現創面的缺氧環境可以通過下調AMPK誘導mTORC1下游靶點p70S6K（Thr389），4E?BP1（Thr70）表達上升來促進細胞運動，從而促進創面再上皮化。YAN等［33］研究團隊進一步證實EF通過誘導自噬活性即LC3?II增多，增強角質形成細胞遷移的距離和速度，但其遷移不是方向性的而是自噬體依賴性的，即EF以恒定自噬通量誘導自噬體形成的時間依賴性。此結果揭示了EF的作用機制，即增強EF使細胞定向運動的調節劑是自噬，為EF促進創面愈合提供了新視角。

2.4 自噬促進創面瘢痕形成瘢痕是創面損傷后皮膚結締組織修復的結果，其特點是成纖維細胞的增殖與膠原蛋白的沉積等。創面在形成瘢痕時，成纖維細胞中LC3陽性點數量增加，且創面邊緣高于中心［34］，表明自噬與成纖維細胞的功能相關。YOON等［35］通過對比瑞芬太尼預處理過氧化氫組、過氧化氫組、3?MA+瑞芬太尼預處理過氧化氫組人皮膚成纖維細胞，結果顯示瑞芬太尼預處理過氧化氫組通過PI3K信號通路上調ATG5、Becline?1、LC?3 II的表達，激活自噬，進而激發人皮膚成纖維細胞對氧化應激的保護作用，使細胞中的氧化應激作用減輕，促進成纖維細胞增殖，幫助創面修復。當皮膚受到熱損傷時，膠原蛋白會產生變性，變性的膠原蛋白一方面作用于procas?pase?3，使其表達下降，減少細胞凋亡；另一方面隨著變性膠原蛋白濃度的增加和時間的延長可通過PI3KC3途徑上調LC3?II/LC3?I和beclin?1的表達，顯著增加人皮膚成纖維細胞的自噬水平，最終幫助細胞存活［36］，促進了創面瘢痕形成。

此外，有學者證實抗凋亡蛋白Bcl?2和BAG3表達上調促進了自噬從而參與了瘢痕形成。JIAN?LI研究團隊在他們的研究中發現，用五谷蟲提取物涂抹全層皮切除的大鼠動物模型時，五谷蟲提取物不僅激活了自噬，使Beclin 1、LC3 II表達增加；而且激活了Smad2/TGF?β和STAT3信號通路，使下游效應分子BAG3和Bcl?2表達增加，致使抗凋亡活性增強，進而減少傷口組織中成纖維細胞的凋亡，最終增加成纖維細胞及TGF?β的數量，促進膠原蛋白形成，提升創面愈合率，縮短創面愈合時間［37］。這就表明Bcl?2和BAG3表達上調促進了自噬從而參與了創面愈合。而有研究員從反方向證明了Bcl?2表達上調促進了自噬，從而參與了創面愈合中的瘢痕過程，MYTYCH等［38］的發現成纖維細胞中的一種抗炎蛋白klotho的沉默，可使caspase?3增多和Bcl?2表達下調，并誘導成纖維細胞凋亡；此外，還可導致ATG16L和LC3表達的減少，而自噬則被抑制，進而誘導NF?κB和IGF?IR通路激活，促炎因子TNF?α，IL?6，IL?1β的分泌增加及抗炎因子IL?10的分泌抑制，最終抑制成纖維細胞增殖，傷口愈合過程顯著被抑制。

2.5 糖尿病慢性創面以上研究均證實自噬參與了創面愈合的多個階段。隨著近年來糖尿病慢性創面的進一步研究，有學者發現在高糖背景下自噬也參與了創面愈合相關細胞的作用過程。高糖環境下，角質形成細胞的遷移能力受損，LINGFEI等［39］用高濃度葡萄糖干預角質形成細胞，通過下調p38/MAPK信號途徑使自噬相關蛋白Atg5和LC3?II的表達顯著降低，自噬被抑制，細胞遷移速度下降；而p38/MAPK激活劑MKK6可顯著改善細胞自噬，促進細胞遷移。褪黑素是AMPK信號傳導的激活劑，JIN等［40］證實采用糖尿病小鼠進行全層皮切除，同時每天腹膜內注射褪黑激素溶液10 mg/kg，不僅可以使Bcl?2表達上調，Bax、caspase?9和細胞色素c表達降低，明顯減輕EPCs凋亡；同時還可以通過激活AMPK信號途徑提高LC3?II/LC3?I比率，降低p62蛋白質水平，增強EPCs中自噬通量，最終促進EPs遷移和粘附，毛細血管數量明顯增加，縮短糖尿病慢性創面愈合時間。MEBT/MEBO是一種中醫療法，可大大提高臨床上潰瘍傷口愈合的有效性，AITIAN等學者［41］用糖尿病大鼠進行全層皮切除，MEBT/MEBO組通過激活了PI3K?Akt?mTOR信號通路激活自噬，促進糖尿病潰瘍傷口的修復與愈合。綜上所述，外部干預可改善糖尿病環境下受損的細胞活性，這為糖尿病慢性創面的臨床干預提供新見解。

3 展望

綜上所述，自噬貫穿了創面愈合的整個過程。研究證實自噬在創面愈合過程中可減少炎性因子的產生、促進ECs增殖、再上皮化和瘢痕形成，其也可改善高糖環境下受損的細胞活性，因此進一步明確自噬在創面愈合過程中的具體作用機制，并開發靶向自噬相關通路的藥物，將有望為臨床中促進創面愈合提供更有效的治療手段。但自噬在創面愈合中的相關研究仍局限在基礎研究層面，且具體作用機制仍不完全清楚，仍存在大量亟待解決的問題，如自噬在創面愈合各個時期的重要性仍有待進一步明確，自噬過分促進瘢痕的形成是否會增加后續抗瘢痕治療的難度，以及過分促進自噬可能引發一系列并發癥等等。

此外，如前文所述創面損傷產生的ROS在抗氧化劑的作用下可促進自噬，減輕凋亡，保護細胞免受氧化應激損害，但其具體機制還不明確，所以筆者認為深入研究ROS作用于自噬和凋亡的具體機制，同時在抗氧化劑的干預下，爭取最大化改善細胞活性，這無疑將為后續細胞治療成功應用于創面修復做鋪墊。這將為今后臨床工作中應用自噬調控改善創面愈合以及為其治療提供更多的選擇方案。