新疆小麥阿拉伯木聚糖阿魏酸?；D移酶基因 TaBahd-A1等位變異檢測及其分布規律

戰帥帥，嚴勇亮，劉鑫源，王麗麗，耿洪偉

(1.新疆農業大學農學院，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆農業大學生物技術重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆農業科學院農作物品種資源研究所，新疆烏魯木齊 830091)

小麥是我國主要糧食作物之一。不同傳統食品如面條、餃子、饅頭等對小麥面粉品質具有不同的要求，品質改良已成為小麥遺傳改良的重要內容[1]。阿拉伯木聚糖(arabinoxylan，AX)是小麥中重要的親水性非淀粉多糖，雖然含量較低 (2.3%～6.8%)[2]，但可通過阿魏酰阿拉伯木聚糖(feruloyl arabinoxylan，FAX)結構中的阿魏酰基氧化交聯形成凝膠網絡[3]，進而影響小麥的加工品質(面筋含量、面粉的水分和吸水性)[4]，另外，AX還具有免疫調節[5]、抗氧化[6]、促進膳食[7]和腸道益生菌特異性增殖[8]等生物活性作用。AX的結構和性質對其功能有重要影響，而FAX含量高低是決定小麥AX結構和性質的關鍵因素[9]。利用功能標記對新疆小麥進行等位變異檢測，揭示FAX含量相關基因在不同小麥品種(系)中的遺傳變異規律，可為小麥分子育種改良提供一定參考。

有關FAX的研究已由性能方面逐步向基因挖掘層面深入研究[9]。國內外研究指出，小麥FAX由植物特有的BAHD家族的阿拉伯木聚糖阿魏酸?；D移酶(arabinoxylan feruloyl transferase，AFT)催化合成[9]。張岐軍等[10]認為基因型是影響水溶性阿拉伯木聚糖含量的主要因素，基因型和環境互作影響不顯著。目前，利用不同小麥群體對AX和FAX含量性狀進行全基因連鎖分析、全基因組關聯分析(genome-wide association studies，GWAS)已有相關報道[11]。 Nguyen等[12]利用雙單倍體(doubled haploid，DH)群體在2A和4D染色體上檢測到與AX含量相關的兩個主要的數量性狀位點(quantitative trait loci，QTL)。呂文娟等[13]利用周麥16/藁城8901的176個重組自交系(recombinant inbred lines，RIL)群體，使用90 K的iSelect基因芯片對FAX含量進行全基因組連鎖分析，檢測到5個在多個環境下穩定表達的QTL，分別位于2AS、2BS、2DL、3AS和6AS染色體上，其中在3A染色體上發現的QFax.xjau-3AS上可解釋最大的表型變異(18.2%)。Zhan等[14]分別以166份黃淮冬麥區和90份北部冬麥區品種(系)為材料，分別利用小麥90 K SNP 芯片的18 189 和13 198 個高質量SNP標記，對FAX含量進行GWAS，其中，在黃淮冬麥區材料中共檢測到83個與FAX含量顯著相關的SNP標記(P<0.001)，在北部冬麥區材料中共檢測到33個與FAX含量顯著相關的SNP標記(P<0.001)，并利用距QFax.xjau-3AS最近的SNP標記進行檢測，驗證了小麥第3同源染色體組上存在調控FAX含量的主效 基因。

迄今為止，大麥(HordeumvulgareL.)、水稻(OryzasativaL.)和普通小麥(TriticumaestivumL.)的AFT基因已被克隆[15-16]。戰帥帥等[16]應用FR846233為探針，克隆了3A染色體上的TaBahd-A1基因，并基于該基因的SNP位點，開發了2個互補顯性標記AFTA2和AFTB2，用于分辨等位變異TaBahd-A1a(與高FAX含量相關)和TaBahd-A1b(與低FAX含量相關)。Geng等(待發表)從4個RIL群體的8個親本中發現了TaBahd-A1基因的新的等位變異類型TaBahd-A1c，并開發了功能標記AFTC8，用于分辨等位變異TaBahd-A1c(與高FAX含量相關)。

目前尚無新疆小麥FAX含量相關基因等位變異檢測的報道。因此，本研究利用TaBahd-A1基因位點已開發的功能標記AFTA2、AFTB2和AFTC8對新疆冬小麥進行等位變異分子檢測，明確TaBahd-A1位點的等位變異在新疆冬小麥材料中的分布，以期為新疆小麥品質遺傳改良提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為124份新疆小麥品種(系)，其中98份為冬小麥品種(系)，包含自育品種(系)43份，引進品種(系)38份，地方品種17份；26份為新疆春小麥品種(系)，全部為自育品種(系)。上述材料包含了新疆麥區不同時期主要種植品種(系)和骨干親本及選育的品種，具有很好的代表性。2018-2019年度種植于新疆瑪納斯試驗基地，隨機區組設計，3次重復，3行區，行長2 m，行距25 cm，田間管理按照當地常規栽培管理方式，小麥田間長勢良好，正常收獲，無倒伏和穗發芽現象。全部材料均由新疆農業大學農學院小麥遺傳育種課題組收集。

1.2 小麥基因組DNA的提取

參考Zhan等[14]的方法，采取酚氯仿抽提法進行小麥DNA提取，試劑取用量略加改良。

1.3 PCR擴增與檢測

1.3.1 檢測引物

利用戰帥帥等[16]開發的顯性互補標記AFTA2、AFTB2及Geng等(待發表)開發的標記AFTC8對新疆小麥材料3A染色體上TaBahd-A1位點進行等位變異檢測。PCR擴增的目標片段大小以及引物序列等相關信息詳見表1，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 TaBahd-A1基因等位變異引物序列、擴增片段

1.3.2 PCR反應體系及擴增程序

以小麥基因組DNA為模板，在MJ Research PTC-200 PCR儀上進行PCR，PCR擴增體系為25 μL，包括Taq DNA polymerase(2.5 U· μL-1)0.25 μL，上、下游引物(4 μmol·L-1)各1.0 μL，dNTP(2.5 μmol·L-1)1 μL，10×Loading Buffer 2.5 μL，然后用水補充至25 μL。所有試劑均購于北京天根生化科技公司。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，退火溫度如表1所示，退火50 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR擴增產物的電泳檢測

利用1.2%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測，電泳時所采用的緩沖液體系為 1×TAE溶液，120 V電壓電泳30～40 min， 0.5%的溴化乙錠(EB)染色15 min，蒸餾水漂洗后平鋪在VILBER LOURMAT凝膠成像系統上，拍照并保存到計算機中。

1.4 統計方法

對124份新疆小麥品種進行編號，根據每個小麥品種(系)3粒種子基因組DNA的檢測結果，判斷該品種的TaBahd-A1位點等位變異類型，選擇PCR產物條帶明晰、單一且符合目標條帶位置的結果進行統計，若結果不一致，需重新提取該品種的其余籽粒DNA，并重新檢測。

2 結果與分析

2.1 新疆小麥品種的 TaBahd-A1等位變異類型

AFTB2在攜帶等位變異TaBahd-A1b的材料(阿克庫孜蓋、白冬麥、熱衣木夏、早洋麥和新冬22號)中能擴增出438 bp的片段，而在其他材料中不能擴增出該片段(圖1)。AFTA2在攜帶等位變異TaBahd-A1a的材料(納瓦提然、綏來小紅冬麥、紅旗1號、新冬41號和新冬5號)中能擴增出692 bp的片段，而在其他材料中不能擴增出該片段(圖2)。AFTC8在攜帶等位變異TaBahd-A1c的材料(北京7號、拉瓦得朗、新冬17號、新冬20號、新春22、伊農16、昌冬5號和喀冬4號)中能擴增出782 bp的片段，而在其他材料中不能擴增出該片段(圖3)。

M：Marker DL2000；1：阿克庫孜蓋；2：白冬麥；3：熱衣木夏；4：早洋麥；5：新冬22號；6：納瓦提然；7：綏來小紅冬麥；8：紅旗1號；9：新冬41號；10：新冬5號。下同。

圖2 功能標記AFTA2對10種材料的多態性檢測

M：Marker DL 2000；1：北京6號；2：北京7號；3：新冬15；4：拉瓦得朗；5：新冬17號；6：新冬20號；7：新春22；8：伊農16；9：昌冬5號；10：喀冬4號。

2.2 不同類型新疆小麥品種中 TaBahd-A1基因等位變異的分布頻率

通過對TaBahd-A1基因等位變異在冬小麥品種(系)和春小麥品種(系)的頻率分布進行統計分析，結果(表2～4)發現，124份新疆小麥品種(系)中，17份材料攜帶與高FAX含量相關的TaBahd-A1a等位變異基因，占13.7%;71份材料攜帶與低FAX含量相關的TaBahd-A1b等位變異基因，占57.2%；36份材料攜帶與高FAX含量相關的TaBahd-A1c等位變異基因，占29.1%。98份冬小麥品種(系)中，攜帶TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異的材料占比分別為12.2%和26.5%；攜帶TaBahd-A1b等位變異的材料占比61.3%。在26份新疆春小麥品種(系)中，攜帶TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異的材料占比分別為 19.2%和42.3%；攜帶TaBahd-A1b等位變異的材料占比38.4%。在不同類型冬小麥品種(系)中，TaBahd-A1a等位變異的分布頻率表現為引進品種(系)>地方品種>自育品種(系)，TaBahd-A1b等位變異的分布頻率表現為自育品種(系)>地方品種>引進品種(系)，TaBahd-A1c等位變異的分布頻率表現為自育品種(系)>引進品種(系)>地方品種。

表2 新疆春小麥品種(系)的 TaBahd-A1基因型

3 討 論

3.1 功能標記的選擇

選用快速、準確、經濟的分子標記是加速小麥品質改良的有效手段[17]。近幾年功能標記在小麥品質[18]、穗發芽[19]、產量[20]、抗旱[21]等方面作為輔助分子育種的有效手段，已逐漸成為研究熱點。戰帥帥等[16]選用與FAX含量相關的基因特異性分子標記AFTA2和AFTB2，利用中國春缺體-四體系將其定位于3A染色體上，并利用功能標記AFTA2 和 AFTB2對253份國內外冬小麥品種(系)材料進行檢測，表明不同基因型間FAX含量的差異達到顯著水平(P<0.05)，驗證了標記的實用性[16]。而中國春缺體-四體系是小麥遺傳研究學珍貴的科研資源，過去十幾年時間內，定位了許多基因的染色體物理位置[22]。Hessler等[22]將硬粒小麥的LOX基因定位于4BS染色體上。Geng等[23]將普通小麥TaPod-D1基因開發的功能標記定位于7D染色體上。同樣，Geng等(待發表)將開發的標記AFTC8定位于3AL染色體上，用于新等位變異TaBahd-A1c的檢測。FAX含量是由多基因控制的復雜數量性狀，呂文娟等[13]研究表明，位于3A染色體上的QFax.xjau-3AS可解釋的表型變異最大，因此，本研究選用此位點所開發的功能標記對新疆小麥品種(系)進行等位變異檢測，為高面筋含量新疆小麥品種的選育提供一定依據。下一步將繼續挖掘3B、3D染色體上的相關功能標記，通過多基因分子標記組合檢測，提高輔助育種選擇的準確性。

表3 新疆冬小麥品種(系)的 TaBahd-A1基因型

(續表3 Continued table 3)

表4 新疆小麥品種 TaBahd-A1基因等位變異檢測及分布規律

3.2 不同類型新疆小麥品種中 TaBahd-A1等位變異的分布規律

本研究發現，98份新疆冬小麥品種(系)中，攜帶與高FAX含量相關的等位變異類型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分別為12.2%和26.5%，而攜帶與低FAX含量相關的等位變異TaBahd-A1b的材料有60份，占 61.3%，表明新疆冬小麥材料中，TaBahd-A1b型占主導地位，可能是新疆地區對小麥阿拉伯木聚糖關注度不高，FAX含量對小麥品質方面研究起步較晚造成的。本研究發現，26份新疆春小麥品種(系)中，攜帶與高FAX含量相關的等位變異類型TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的材料占比分別為19.2%和42.3%，而含有與低FAX含量相關的等位變異類型TaBahd-A1b占比為38.4%。白 璐等[24]利用新疆春小麥材料對TaLox-B1位點進行檢測，表明早期品種均為優異等位變異的材料，其分布頻率遠高于晚期品種。因此，推測本研究所使用的春小麥材料可能包含較多的早期品種，是TaBahd-A1c基因型的材料分布頻率較高的原因之一。因此，通過選擇具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異基因的小麥品種(系)，有助于小麥品質性狀的遺傳改良。

新疆自育和外引品種與地方品種間均存在明顯的遺傳差異。本研究發現，在不同類型冬小麥品種(系)中，與高FAX含量相關的TaBahd-A1a和TaBahd-A1c的分布頻率表現為引進品種(系)>地方品種>自育品種(系)；與低FAX含量相關的TaBahd-A1b的分布頻率表現為自育品種(系)>地方品種>引進品種(系)。這可能與新疆小麥品種(系)的演變有關，早期的地方品種在后期被有選擇性的引進品種所取代，引進品種在長期的選育中，逐漸積累具有與高FAX含量相關的優異等位變異。因此，在新疆小麥品種(系)育種中，通過選擇具有TaBahd-A1a和TaBahd-A1c等位變異基因的引進小麥品種(系)，可以選育出高FAX含量的小麥品種。

3.3 不同麥區 TaBahd-A1等位變異的分布規律

新疆冬麥區的小麥與其他冬麥區小麥相比，其優異等位變異TaBahd-A1a的分布頻率占比較低。戰帥帥等[16]研究表明，在北部冬麥區和黃淮冬麥區，與高FAX含量相關的等位變異TaBahd-A1a占比遠高于與低FAX含量相關的等位變異TaBahd-A1b(36%)。新疆地區小麥與其他麥區之間表現出的差異，反映了一定程度的地域特性，可能與其他麥區早期就有針對性地選育強筋、面團流變學特性較好的小麥品種有關。Hao等[25]也指出，對于同一基因組，不同麥區具有不同的選擇牽連作用。且FAX含量為多基因控制的數量性狀，利用全基因組連鎖分析[13]及全基因組關聯分析[14]的方法，均在不同染色體上發現有多個有效位點，不同染色體的基因互作及同一染色體基因不同位點的影響都可能導致不同麥區的差異。

此外，本研究僅對新疆冬小麥材料中FAX含量相關位點TaBahd-A1等位變異進行了基因型檢測，暫未對其進行FAX含量測定和關聯驗證。今后，我們將進一步對新疆小麥FAX含量進行檢測，并結合基因型進行顯著性分析，同時開發其他染色體上與FAX含量相關的功能標記，通過優異等位基因的組合，進一步提高分子標記輔助育種的準確性，進而對小麥品質遺傳改良提供參考。