EGLN3 在腫瘤發生發展中作用的研究進展

蔡鳳琳 綜述，鄧靖宇 審校

（天津醫科大學腫瘤醫院胃部腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

細胞感知氧濃度、維持氧穩態的能力是自然界高度進化的產物。在低氧反應中，機體通過增加糖酵解、促進紅細胞和血管生成以維持細胞活性。其中，缺氧誘導因子（hypoxiainduciblefactors，HIFs）在這一適應性反應過程中起著關鍵作用。由于低氧狀態在腫瘤內的普遍存在以及HIFs 在維持氧穩態過程中發揮的核心作用，氧感知通路的分子調控在腫瘤研究領域引起了廣泛關注。許多研究已經闡明了HIFs及相關通路因子在調節腫瘤細胞生長、轉移以及血管生成中的機制。脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylases，EGLNs）對HIF 亞基中特定的脯氨酸殘基具有氧依賴性羥化作用，控制參與細胞生存、代謝和血管生成的基因的轉錄[1]。脯氨酸羥化酶3（EGLN3）作為一種獨特且功能多樣的EGLN 亞型，成為近年來惡性腫瘤等多種疾病研究的熱點。本文就EGLN3 在腫瘤發生、發展中作用的研究進展做一綜述。

1 EGLN3 及重要家族成員的結構與功能

EGLN3，也稱為PHD3/HIFPH3，是一種Fe(Ⅱ)依賴型雙加氧酶，屬于EGLN 家族中HIF-P4Hs（hypoxia inducible factor-prolyl 4-hydroxylases, HIFP4Hs）亞家族[1]。已知在哺乳動物中該亞家族包括4個成員：EGLN1/PHD2/HIFPH2、EGLN2/PHD1/HIFPH1、EGLN3/PHD3/HIFPH3 以及內質網跨膜脯氨酸羥化酶（transmembrane prolyl 4-hydroxylase,P4H-TM）[2]。其中P4H-TM 的催化位點位于內質網腔內，與其他3 種EGLNs 幾乎沒有序列同源性，主要在促紅細胞生成的調節中發揮作用[2]。目前普遍認知的細胞氧傳感器包括EGLN1-3，它們通過催化HIF-1α 蛋白中脯氨酸殘基羥基化，參與氧感知途徑。

1.1 羥基化功能結構域與靶蛋白結合域 EGLNs的C 端催化結構域具有高度的序列同源性，但它們的N 端結構域卻截然不同，表明N 末端結構可能決定了3 種EGLN3 的功能特異性。人類基因表達的EGLN3 包含239個氨基酸殘基，與EGLN1 和EGLN2（分別由426、407個氨基酸殘基組成）相比，其N 末端長度較短[3]。研究發現，EGLN1 和EGLN2 的N 末端含有限制它們與E3 泛素連接酶Siah2 直接相互作用的結構域，而EGLN3 缺乏這種N 端延伸結構，使Siah2 優先對EGLN3 進行靶向降解[4]。

常氧狀態下，EGLNs 的羥化結構域識別位于HIFα 亞基中氧依賴降解區（oxygen-dependent degr adation domains，ODDD） 內 的特定序列LXXLAP（Leu-X-X-Leu-Ala-Pro），催化兩個高度保守的脯氨酸殘基Pro402 和Pro564 羥基化來實現對HIF-1α 的調控，使HIF-1α 被E3 泛素連接酶（von Hippel-Lindau,VHL）識別和泛素化修飾，進而經蛋白酶體水解，以維持HIF-1α 的蛋白表達水平[5-6]。而缺氧環境下的EGLNs 失去其催化活性，導致HIF-1α 積累并異位至核內與組成型表達的HIF-1β 亞基結合形成異源二聚體，最后通過結合缺氧反應元件（HRE）激活下游靶基因的轉錄[5-6]。

EGLNs 在參與調節HIFα 亞基（HIF-1α 和HIF-2α）時具有傾向性，研究顯示定位于細胞質中的EGLN1 是調控HIF-1α 最有效的關鍵酶，EGLN2 局限于細胞核中，對HIF-2α 的催化作用比HIF-1α更為活躍，而EGLN3 在細胞質和細胞核中均勻分布，對HIF-2α 的羥化作用強于HIF-1α[7]。EGLNs 對HIFα亞基的C 端氧依賴降解域（C-terminal oxygen-dependent degradation domains，CODD）與N 端氧依賴降解域（N-terminal oxygen-dependent degradation domains，NODD）的脯氨酸殘基也具有不同的親和力，表現在EGLNs 在CODD 上的催化活性更強，特別是EGLN3 對CODD 具有絕對選擇優勢，而在NODD上實際無羥化作用[8]。

1.2 反應底物與輔助因子 EGLNs 以氧和2-酮戊二酸（2-oxoglutarate，2-OG）作為反應底物，亞鐵離子和抗壞血酸作為輔助因子，對氧濃度高度敏感。當2-OG 水平異常或細胞中的氧化還原狀態改變時，EGLN3 的酶活性會受到顯著影響。

（1）分子氧：氧濃度是控制EGLNs 催化羥基化反應最主要的因素。O2分子在羥基化反應中有兩條消耗途徑：與受體脯氨酸殘基的羥基結合，以及與2-OG 經氧化脫羧反應生成琥珀酸[9]。

（2）2-酮戊二酸：2-OG 是EGLNs 的重要底物之一，也是三羧酸循環的關鍵中間產物，能夠抑制EGLN3 的表達。動物實驗研究發現，將異種移植瘤小鼠每日給予酯化2-酮戊二酸治療，可誘導細胞凋亡并抑制腫瘤生長，該效應依賴于EGLN3 的存在，而與HIF-1α 無關[10]。

（3）亞鐵離子Fe（Ⅱ）與抗壞血酸：亞鐵離子是EGLNs 羥化作用的輔助因子，對活性氧簇等強氧化劑敏感。低氧時活性氧簇水平增加可提高HIFs 的穩定性，因為Fe（Ⅱ）氧化狀態限制了EGLNs 的羥化活性[11]。EGLNs 這種強烈的Fe（Ⅱ）依賴性也有力地佐證了抗壞血酸對脯氨酸羥化作用的積極意義。抗壞血酸對氧化的鐵離子具有還原性，因此在Fe（Ⅱ）氧化的情況下能夠恢復EGLNs 的酶活性。

2 EGLN3 的表達調控

2.1 HIFs 依賴性通路的調控 EGLN3 與其他兩種EGLN 蛋白在HIF 依賴性氧感知通路的調節中均起著重要作用，這種調節在很大程度上取決于它們在特定培養條件下的相對豐度。這一現象在Appelhoff等[5]設計的實驗中得到了有力的說明。標準常氧培養條件下細胞EGLN1 表達最豐富，而EGLN3 水平相對較低。但低氧信號誘導EGLN3 表達的效應比EGLN1更明顯，且通過siRNA 抑制EGLN3 對HIFs 調節系統有著顯著的影響。有文獻指出，缺氧引起的EGLN3上調是通過HIFs 與含有核心序列[A/G]CGT 的功能性HRE 結合而導致的轉錄反式激活[9]。缺氧環境使EGLN3 催化活性降低的同時，蓄積的HIFα、β 亞基異源聚合形成功能性轉錄因子，該異二聚體結合HRE，反向激活EGLN3 并調節血管內皮生長因子（VEGF）、促紅細胞生成素（EPO）、葡萄糖轉運蛋白（GLUT）-1 和GLUT-3 和糖酵解酶等基因的轉錄，參與細胞增殖、分化、代謝、遷移以及血管形成[6]。

2.2 HIF 非依賴性通路的調控 EGLN3 主要通過HIF 依賴性羥基化作用實現對下游靶基因的調控。然而除經典的HIF 羥化作用之外，EGLN3 也能夠不依賴羥化酶活性，通過其他方式參與某些信號通路中樞蛋白的調節，例如競爭性抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制蛋白（IκB）激酶β(IKKβ)的活化影響NF-κB 信號轉導[12]；作為支架蛋白介導早期內吞銜接子如Eps15 和epsin1 向表皮生長因子受體（EGFR）募集，調節EGFR 的內吞內化過程[13]；通過旁路抑制血小板源性生長因子（PDGF）-C 信號轉導途徑[14]。HIF 非依賴性調控通路的發現進一步補充了EGLN3 的信號調節網絡，表明EGLN3 具有羥化作用之外的功能特性。

3 EGLN3 在腫瘤中作用的研究進展

缺氧影響著腫瘤發生、發展的全過程，EGLN3 的主要靶蛋白——HIFs 在腫瘤低氧環境下激活多種致癌途徑的基因表達，包括增強丙酮酸激酶同工型PKM2 表達，參與糖酵解代謝重編程，使腫瘤細胞獲得缺氧環境中的生長優勢；刺激VEGF 和EPO 的分泌，促進腫瘤血管生成；誘導轉化生長因子（TGF）α，促進腫瘤上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）獲得侵襲表型[15]。EGLN3 在多種腫瘤中呈低表達，表現出抑癌特性，通過HIF 依賴性與非依賴性調控通路影響腫瘤的發生、發展。但EGLN3尚不能作為一種絕對的抑癌基因，在某些腫瘤類型中EGLN3 也存在促癌效應。目前研究者們分析了EGLN3 在不同癌種中的調控機制，以期尋找新型治療方法改善患者預后。

3.1 肺癌 轉移與耐藥是肺癌亟待攻克的兩大難題。Dopeso 等[16]對EGLN3 在肺癌轉移中的作用進行了分析討論，揭示了EGLN3 與EMT 之間存在復雜的聯系。EMT 是癌癥轉移的重要環節，可通過TGFβ/SMAD 信號和EGFR 信號通路誘導激活[16]。EGLN3 在TGFβ/SMAD 信號激活后表達沉默，使HIFs 蛋白表達水平增高，HIFs 刺激下游靶基因TGFα 的轉錄和分泌，增強SMAD 信號轉導，而TGFα作為EGFR 的配體，可通過激活EGFR 通路進一步實現對EMT 的正反饋調控，促進腫瘤轉移；相反，EGLN3 重新表達則抑制了EMT 和肺腫瘤轉移[16]。此外，EGLN3 可能通過抑制HIF 依賴的PKM2 途徑調控肺癌轉移。Chu 等[17]發現EGLN3 過表達可顯著下調HIF-1α 和PKM2，肺癌細胞的活性、遷移和侵襲能力隨著EGLN3 過表達而顯著降低（P＜0.05）。PKM2 是HIF1 的直接靶基因，在多項研究中被證實對腫瘤的侵襲、轉移具有促進作用。由此可見，EGLN3在肺癌中對PKM2 的負向調控可能是抑制肺癌轉移的重要機制。針對肺癌治療耐藥性的研究中，EGLN3 表現出對肺癌靶向藥物厄洛替尼（EGFR 抑制劑）耐藥性的負向調控。EGLN3 表達沉默引起HIF介導的TGFα 的轉錄，TGFα 是維持EGFR 過度激活的關鍵因子，在應用EGFR 抑制劑進行治療的情況下仍能維持EGFR 活性，產生藥物抗性。在EGLN3重新表達后，TGFα 轉錄受限，肺癌細胞對厄洛替尼的敏感性得以恢復[16]。目前認為EGLN3 對控制肺癌轉移和耐藥性具有積極作用，但這種影響是否還涉及其他通路的調節仍需要進一步研究。

3.2 胃癌 多項臨床研究結果表明，與癌旁組織相比，EGLN3 在胃癌組織中呈低表達，其表達水平與腫瘤分化程度、腫瘤大小和臨床分期顯著相關，提示EGLN3 具有抑癌效應，可作為判斷胃癌預后的指標[18-20]。EGLN3 的抑癌機制可能涉及對某些致癌途徑的負向調控。目前發現在胃癌中起致癌作用的分子通路主要包括Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）、NF-κB、刺猬蛋白（Hedgehog，Hh）和表皮生長因子受體信號轉導途徑。在Wnt/β-catenin 通路中，βcatenin 在Wnt 信號激活時可免受泛素化蛋白酶體水解作用，獲得穩定性，不斷積累進入胞核，與T 細胞因子（TCF）等轉錄因子結合，刺激致癌基因（如c-myc、cyclinD1）的轉錄，從而誘導腫瘤發生并獲得惡性表型[21]。值得注意的是，這種β-catenin/TCF 信號活性受EGLN3 的表達水平影響，EGLN3 能夠促進β-catenin 的泛素化降解來抑制β-catenin/TCF信號轉導，使該通路誘導的致癌性得以控制[19]。但EGLN3 影響β-catenin 泛素化修飾的具體過程未系統闡釋。此外，EGLN3 也被證實能夠在胃癌中通過經典的HIF 羥化途徑負向調節HIF-1α 及下游促癌基因的轉錄活性，降低胃癌細胞的遷移和侵襲能力，抑制腫瘤脈管系統的形成[20]。EGLN3 在胃癌中表現出較明顯的抑癌效應，具有作為胃癌新型治療靶點的潛力。

3.3 結直腸癌 在原發性結直腸癌患者腫瘤組織中，EGLN3 表達降低，它可能是一種抑癌因子，在結直腸腫瘤細胞與組織學中均表現出抑癌特征。2010年，Xue 等[12]報道了EGLN3 能夠抑制IKKβ 磷酸化與NF-κB 的激活。NF-κB 在結直腸癌中被廣泛激活，是推動腫瘤發展的重要轉錄因子。正常情況下它與NF-κB 抑制劑——IκB 蛋白結合，以無活性狀態局限于細胞質中，但在IκB 激酶α/β 受磷酸化激活時，IκB 蛋白被誘導降解，NF-κB 暴露核定位序列獲得入核能力，刺激核內靶基因（促炎因子、HIF 等）轉錄翻譯，導致腫瘤惡性進展。活化NF-κB 的關鍵酶——IKKβ 的磷酸化激活需要伴侶蛋白Hsp90 的協同作用，而EGLN3 與IKKβ 的結合能夠競爭性抑制Hsp90 與IKKβ 結合產生的磷酸化效應（EGLN3與IKKβ 共定位，結合位點與Hsp90 相同），從而抑制IKKβ/NF-κB 誘導的腫瘤生長[12]。Radhakrishnan等[22]提出，EGLN3 也具有抑制結直腸癌的轉移擴散的作用，這一效應與新發現的EGLN3 下游分子MCL-1 有關。MCL-1 屬于BCL-2 抗凋亡家族，定位于線粒體，能夠維持并增強線粒體功能，增加ATP 的產生，這種能量代謝的活躍促進了癌細胞的轉移。EGLN3 使MCL-1 表達降低，從而抑制了MCL-1 介導的能量產生和癌細胞遷移。但EGLN3 通過何種方式抑制MCL-1 還需進一步探討。最近Xu 等[23]將EGLN3 與結腸癌干細胞活性聯系起來，發現EGLN3能夠與原癌基因MDM2 結合，抑制MDM2 介導的p53降解，影響腫瘤干細胞活性。MDM2 是一種E3 泛素連接酶，包含N 端p53 結合域、中間酸性域和C 端鋅指結構。中間酸性域是控制p53 泛素化降解的關鍵結構之一，EGLN3 通過與該結構域結合抑制p53的降解，使p53 穩定性增強并負向調控干細胞相關基因的表達，從而減弱結腸癌干細胞活性。

3.4 胰腺癌 胰腺癌絕大部分起源于外分泌部的導管上皮細胞，主要為導管腺癌，因其侵襲性強，臨床預后不良。持續性缺氧是胰腺腫瘤微環境的典型特征，根據先前報道的EGLN3 在低氧反應中表現出強敏感性，研究者們分析了EGLN3 在胰腺癌發生、發展中的作用機制。首先，Su 等[24]報道了EGLN3 的表達水平與胰腺癌的分化程度相關，EGLN3 低表達的癌組織和細胞表現出更高的惡性特征（腫瘤生長、侵襲遷移、血管生成和抗凋亡）。Tanaka 等[25]提出EGLN3 是抑制胰腺腫瘤血管生成的重要調節蛋白。促進腫瘤血管生成的關鍵因子VEGF 是HIF-1 的靶基因之一，在缺氧環境下分泌增高。胰腺癌中HIF-1α和VEGF 的轉錄分泌受EGLN3 的反向調控，表明EGLN3 可能通過抑制HIF-1/VEGF 途徑阻礙胰腺癌組織血管生成[24-25]。EGLN3 的羥化活性可能還應用于除HIF 外的其他通路。Su 等[24]發現EGLN3在不依賴HIF 途徑的情況下引起了胰腺腫瘤細胞形態變化，它可能通過羥化作用使黏著斑激酶（FAK）磷酸化增加，誘導增強細胞收縮性的應力纖維的形成。應力纖維與FAK 的活化是細胞遷移侵襲的基礎條件，與EGLN3 本身所表現出的抑制侵襲遷移特點并不相符。對此研究者進一步分析認為促凋亡機制可能是胰腺腫瘤生長、侵襲遷移能力受限的原因之一[24]。EGLN3 通過激活半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3 以神經生長因子NGF 依賴性的方式誘導胰腺癌細胞凋亡。Caspase-3 是參與凋亡信號轉導的重要蛋白，可以切割某些特定的底物，催化裂解。近年來，Tang 等[26]觀察到EGLN3 過表達聯合放射治療能夠將胰腺癌細胞阻滯在對輻射敏感性較強的細胞周期G2/M 期，加劇細胞凋亡。這一效應的機制可能是EGLN3 能夠抑制HIF-1 通路的活化，而HIF-1 則抑制胰腺癌細胞進入G2 期，影響放療療效[26]。由此可見，EGLN3 參與胰腺腫瘤多種惡性表型的調控，有望成為一種新型生物標志物，改善胰腺癌的治療效果。

3.5 腎細胞癌（RCC） RCC 往往存在VHL 等腫瘤抑制基因的突變，這與啟動子CpG 島甲基化或特定microRNA 失調有關。VHL 的表達失調能夠使HIFs免受泛素化降解，引起HIFs 通路中致癌基因表達增強，EGLN3 作為HIFs 通路的重要參與者，在腎細胞癌中可能具有獨特的意義。2011年Tanaka 等[27]檢測到RCC 患者血清中的抗EGLN3 抗體滴度明顯高于健康者，提出抗EGLN3 抗體可作為腎細胞癌血清學標志物。RCC 中EGLN3 高表達有兩種激活模式，在VHL 突變型RCC 細胞（SMKT-R2 和SMKTR3）中，EGLN3 可能由于HIFs 的異常積累負反饋激活，而在VHL 野生型細胞（Caki-1 和ACHN）中則通過PI3K/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白途徑誘導[28]。與其他惡性腫瘤不同的是，EGLN3高表達狀態可能維持腎癌細胞活性。一方面，EGLN3 通過調控細胞周期進程維持癌細胞生長，它使p27（一種周期蛋白抑制劑，誘導細胞周期阻滯于G1/S 期）絲氨酸S10 磷酸化受阻，降低p27 的穩定性以及周期阻滯作用，促使腫瘤細胞進入G1/S期恢復增殖狀態[29]；另一方面，EGLN3 似乎對HIF-2α 存在除羥化作用以外的影響，在腎透明細胞癌中，它與HIF-2α 的表達呈正相關[30]。盡管目前針對EGLN3 在腎癌發展中的作用機制研究較少，但這種反差結果的出現需要重新思考先前對EGLN3作為抑癌基因的認識。EGLN3 還具有多少未知的效應需要我們進一步觀察研究。

4 結語

EGLN3 是惡性腫瘤發展過程中許多重要信號通路的中間環節，對腫瘤的生長、侵襲、遷移、凋亡、血管形成以及干細胞活性均有著不同程度的影響。目前發現，EGLN3 在多種腫瘤類型（如肺癌、胃癌和結直腸癌）中表現出強烈的抑癌效應，它是一種新型生物標志物，有助于腫瘤患者的預后評估。根據現有研究，EGLN3 的靶向調控有望開辟腫瘤的新型治療方法，改善患者的治療效果，未來對EGLN3 作用機制還需更深入的挖掘。