氧化石墨烯在骨組織工程中的研究概況

馬 瑞，劉志輝

氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)是石墨烯衍生物，與其不同之處在于二維單層碳原子結構的邊緣和基底面引入大量含氧官能團[1]，也正因為這些官能團的存在使其容易通過氫鍵、共價鍵、靜電相互作用與其他活性生物分子或支架材料結合，參與生物活性因子的負載以及復合材料的構建，進一步完善了支架材料的理化和生物性能[2-3]，因此GO在骨組織工程領域被廣泛研究。

1 GO對支架材料性能的影響

1.1 力學性能

支架材料作為填充骨缺損的三維結構，必須要有一定的機械強度才能夠維持結構的穩定。殼聚糖(chitosan, CS)、膠原、藻酸鹽等因生物相容性好而被廣泛研究，但機械強度低而導致應用受限。GO表面富含的大量官能團易于與其他材料結合，因此被廣泛應用于復合材料的制備，進而提高材料的機械性能。Ruan等[4]制備GO-羧基化殼聚糖復合支架，因CS富含氨基，與GO產生交聯后，復合支架的彈性模量和硬度，較對照組支架分別提高了2.75倍和3.51倍。聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate，PMMA)在生物醫學中應用廣泛，并首先被用于牙科領域，但不足之處在于其機械強度低。Paz等[5]分別將質量分數0.1%～1.0%的GO作為PMMA骨水泥的增強劑加入其中，研究發現，質量分數≤0.25%時，PMMA/GO骨水泥的機械強度得到了顯著提高。根據學者研究發現，總結出GO增強復合材料機械性能原因可能如下：一，GO表面富含的官能團(例如羧基和羥基)易于與其他材料結合，增加兩者的交聯度，交聯度的增加對支架原聚合物鏈的移動性施加了更大的約束力，提高了界面強度，進而支架的機械性能得以改善[6]；二，GO對于機械性能的改善具有濃度依賴性，當濃度過低時，無法形成充分的交聯，而當濃度過高，GO不能很好地分散在復合基質中，形成單一的聚合物；三，GO作為納米級填料可以在材料斷裂時引起裂紋前沿的偏離并阻礙裂紋的擴展進而提高機械性能。這就要求在選擇GO來增加改善支架的機械性能時，我們要考慮其濃度以使其與其他材料形成充分的交聯。

1.2 降解性能

骨支架材料作為異物置入骨缺損區域，應該具有降解性能同時降解產物無毒性。研究表明，GO具有兩種生物降解途徑，一種是水性自降解，GO在水中時不斷地發生結構的變化，包括碳—碳鍵的斷裂，最后降解為腐殖酸樣結構[7]。另一種是酶促降解[8-9]， Mukherjee[10]發現中性粒細胞會產生一種髓過氧化物酶，其主要介導GO的降解，而且GO的降解速率對該酶具有濃度依賴性，髓過氧化物酶濃度越高，降解速率越快，而且利用人支氣管上皮細胞系作為實驗模型驗證了GO降解后的混合物不會引起遺傳毒性。Purohit等[11]將不同濃度的GO與明膠(gelatin, Gn)、藻酸鹽制備納米復合支架，研究發現28 d后，觀察到空白組支架的降解率為57%，而GO組降解率約為30%，而且隨著GO濃度的增加降解速率減慢，該降解速率有利于骨再生。綜上所述，GO是可降解的并且降解產物無明顯毒性，另外GO與其他材料復合后會改善原支架的降解速率，為骨再生提供更有利的條件，但對于GO在體內降解周期以及具體的降解途徑和排泄途徑仍需要進一步研究。

2 GO對細胞行為的改善

在骨組織工程中，種子細胞在支架材料上的粘附是細胞增殖及成骨分化形成新生組織修復骨缺損的基礎，而支架材料上細胞的增殖分化決定了骨重建的成功與否。良好的細胞粘附是細胞具有紡錘狀的形態以及絲狀偽足的延伸，而評估骨支架材料對干細胞成骨分化的影響通常是在分子水平上進行，Runx2作為骨轉錄因子，在成骨細胞形成和分化中扮演重要角色，骨鈣素(osteocalcin, OC)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣蛋白(osteocalcin, Ocn)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen, COL-Ⅰ)可以作為干細胞向成骨細胞分化的標記物[12-13]。GO對細胞粘附、增殖以及成骨分化能力的影響主要通過以下幾個方面發揮作用的。

2.1 對蛋白的吸附

研究發現細胞對于支架材料的粘附需要一種媒介，而血清蛋白(紐蛋白、纖維連接蛋白等)可以扮演這種角色[14]，GO的基面和邊緣上存在的環氧基、羧基和羥基可通過共價鍵、靜電鍵和氫鍵與蛋白質發生強烈的相互作用，進而促進細胞的粘附，Lee等[15]驗證了這一觀點，他們將間充質干細胞分別在GO膜和聚二甲基硅氧烷膜(polydimethylsiloxane,PDMS)上培養，發現GO吸附高達25%的血清蛋白，而PDMS上的吸附率<1%，所以GO組的細胞觀察到絲狀偽足的延伸和突出，而PDMS組細胞呈圓形態。Luo[16]通過靜電紡絲技術將GO摻入聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米纖維中，與對照組相比，實驗組支架的蛋白質吸附能力以及對地塞米松、抗壞血酸預濃縮能力明顯提高，細胞實驗中進一步發現實驗組ALP、COL-Ⅰ、OC以及Ocn成骨標志物也表達升高。這也提示GO通過增加蛋白吸附能力進一步促進了干細胞的成骨分化。

2.2 親水性的提高

材料的親水性與蛋白質的吸附是相輔相成的[17]。GO表面富含的含氧官能團不僅賦予材料高親水性，同時又可作為蛋白質吸附位點來增強細胞的粘附和增殖。Saravanan等[18]將不同比例的GO、CS與Gn復合構建復合支架，發現與對照組相比，因為GO的存在，GO-CS-Gn支架親水性增強，蛋白質吸附能力也有所提高，光鏡下細胞具有延伸的偽足且增殖良好。同時也上調了Runx2和成骨細胞分化標記基因的表達，證明了GO通過增加材料親水性促進細胞向成骨細胞分化的潛能。

2.3 孔隙率增加

支架材料良好的孔隙率可以促進營養物質的運輸和代謝廢物的清除，為細胞的附著、增殖和分化提供更有利的微環境[19]，Zhou等[20]制備了聚(3-羥基丁酸酯-co-4-羥基丁酸酯)(Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),P34HB)/GO納米纖維支架，與P34HB支架的孔隙率(73.83±2.17)%相比，P34HB/GO支架的孔隙率高達(88.85±2.48)%，細胞實驗也進一步證明，高孔隙率組支架上附著的細胞形態更大且分布更廣，細胞活力以及增殖能力更高，并且ALP、Ocn等高表達，表現出良好的成骨分化能力。這可能是因為孔隙率的提高增加了支架的表面積，為細胞提供更廣闊的生長空間，進而促進細胞的增殖、粘附能力。

2.4 GO的濃度

許多研究學者提出單純GO能否對細胞的增殖、分化產生影響，Elkhenany 等[21]做出驗證，他們將山羊骨髓間充質干細胞接種在涂覆有GO的培養板上，發現即使培養基中不含糖皮質激素和生長因子，干細胞仍被誘導向成骨細胞分化，并可觀察到茜素紅染色的骨礦化結節，表明單純GO可作為成骨誘導物觸發有關成骨分化的分子信號,誘導干細胞成骨分化。但另外其他實驗發現GO的濃度過高時反而對細胞產生不利影響，魏常博等[22]將不同濃度 GO與乳牙牙髓干細胞共培養，結果顯示，低濃度組細胞呈長梭形并顯示出良好的粘附能力，與對照組相比增殖能力明顯提高，并且早期就促進了成骨相關蛋白Runx2高表達，而高濃度組則導致細胞死亡。這可能是由于豐富氧化基團賦予GO良好的親水性有利于細胞的生長，但過高濃度GO可能導致高強度的氧化應激, 損傷細胞;同時GO表面存在的未氧化區域會從細胞脂膜中抽取磷脂分子, 進而損傷細胞[23]。

2.5 機械能力提高

最近一些研究表明細胞底物的機械性能可以改變細胞反應，從而影響細胞表面相互作用以及細胞生長和活力[24-25]。Haugh等[26]發現當支架機械強度增加后，細胞增殖和遷移能力也相應明顯提高。Liang等[27]也證實這一結論，當GO復合到支架材料中，機械性能最高組細胞的粘附增殖生長能力也相應的增加，這表明支架的機械性質與細胞增殖活性密切相關。

2.6 對骨形態發生蛋白-2的緩釋

生長因子在血管的形成和干細胞成骨分化中起積極的促進作用，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)作為應用最廣泛的成骨因子，可誘導干細胞以及多非骨組織來源的細胞株，如多能纖維細胞向成骨細胞分化，進而誘導新骨的形成[28]。除上述作用外，該生長因子可能在血管生成過程中也發揮一定的作用[29]。其中研究最為廣泛的BMP-2已被納入美國食品藥品監督管理局(FDA)并被批準應用于骨再生的治療。但BMP-2誘導干細胞成骨分化往往需要數周，所以理想的支架材料作為生長因子的載體應該在不損害其活性的情況下將其持續釋放[30]。GO因其高比表面積以及特殊的化學結構可以作為負載這些蛋白質等生物活性物質的載體，并且將其持續釋放[31]。因此Zhang等[32]將BMP-2負載在GO上，然后與聚乳酸-羥基乙酸共聚物-β-磷酸三鈣復合，實現了在不破壞BMP-2生物活性的同時對BMP-2的持續釋放，ALP、RUNX-2、Ocn和COL-Ⅰ表達水平明顯提高，促進了干細胞的成骨分化。

3 抗菌性能

細菌感染是造成骨重建失敗的常見原因。因此，賦予骨支架材料一定的抗菌性能是非常有必要的。研究發現[33]GO不僅可以抑制多種細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等)的附著，而且本身也具有一定的抗菌活性。關于GO的抗菌機制目前主要存在以下幾種學說，①膜應力和磷脂提取學說：GO納米片尖銳的邊緣會使細菌胞膜的完整性受損，胞內的RNA隨之流出，最終導致細菌死亡[34-35]。②氧化應激學說：氧化應激會干擾細菌的新陳代謝并破壞細胞的基本功能,其主要通過依賴于活性氧(reactive oxygen species, ROS)引起細胞內蛋白質失活，脂質過氧化，線粒體功能障礙和細胞膜逐漸崩解，并最終導致細胞死亡，GO表面含有的含氧基團(例如—COOH和—OH)可增加ROS的產生，進而使細菌的活性受到影響[36-37]。③誘捕學說：聚集的GO片會覆蓋細菌，將細菌與周圍環境相隔離，阻礙其空氣和營養物質的輸送，但這只是抑菌而非殺菌，GO片去除后，細菌仍可以繼續增殖[38]。此外，研究發現利用GO特有的電子結構以及高表面積優點可將其作為抗菌藥物載體，使抗菌藥物能在病灶區進行局部釋放，進一步而提高抗菌性能。Li[39]利用GO表面的—OH及—COOH基團與巴洛沙星中的甲氨基和羧基形成的強氫鍵作用將兩者結合，后續實驗檢測到了巴洛沙星的持續釋放，抗菌實驗則表明GO可協同增強巴洛沙星的抗菌作用。Jiang等[40]利用聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)修飾的GO作為鹽酸四環素(tetracycline hydrochloride, TCH)的載體及釋放平臺，與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養后發現材料負載的TCH可持續釋放，并展現了良好的抗菌效果。綜上，GO不僅本身具有一定的抗菌性能，還可以作為載體負載抗菌藥物產生協同抗菌作用，這為提高骨支架材料的抗菌性能提供了一個新的方向。

4 小結與展望

我們對有關GO在骨組織工程中對支架性能提高，細胞行為影響，抗菌能力加強做了系統的闡述。提示GO可用于強度低，親水性差材料的改進，可以負載生物活性蛋白或藥物進行緩釋，為骨組織工程中成骨困難以及感染問題的解決開辟新的道路，為承重骨缺損開發更有利的支架。但對于GO在骨組織工程中的應用仍然存在一些重要挑戰。第一，GO的潛在長期毒性應進一步研究。第二，我們對GO-細胞相互作用及其內部機制的理解還不完善，許多假設仍有待檢驗。第三，在確定GO是否為促進植入物或支架材料表面改性的納米材料之前，應先將GO與目前成功的植入物或支架材料的成骨作用進行比較。最后，GO對體內細胞、組織或器官的確切影響及其代謝途徑尚不清楚，需要進一步研究。