干腌火腿微生物研究進展

鞠 銘 劉 鑫 李官浩 鄭乾坤 李 敏 樸春香 崔明勛

(1. 延邊大學食品研究中心，吉林 延吉 133000；2. 山東省得利斯集團有限公司，山東 濰坊 262200)

用腌制和發酵來保存食物是人類歷史上的一個重要發明[1]。由此產生了大量的傳統發酵制品，例如醬油、醋、奶酪、腐乳等[2-3]，這些產品通過微生物作用形成不同于原材料的特殊風味。關于肉制品的保存歷史可追溯至公元前4 000多年的蘇美爾文明[4]。干腌火腿(Dry-cured ham)，作為發酵肉制品中的典型代表物備受關注。一條品質較好的火腿，從屠宰到腌制、干燥、發酵，整個過程至少需經歷18個月[5]，是發酵制品中最耗時的產品之一。在干腌火腿發酵過程中，蛋白質通過水解作用產生大量的小肽和游離氨基酸；脂肪經水解和氧化作用生成高級脂肪酸、甘油、二酰甘油酯[6]，這些產物之間相互作用產生了400多種揮發性風味物質，包括大量的醛類和醇類[7]，這些形成了干腌火腿獨特的風味。

由于地理位置以及原材料品種的差異，經過數百年的發展，東西方形成了一些特征明顯的產品，例如美國的鄉村火腿、西班牙的Iberian火腿和Serrano火腿、意大利的Parma 火腿、法國的Bayonne火腿等。中國比較著名的火腿有浙江金華火腿、江蘇如皋火腿、云南宣威火腿和鄧諾火腿等[8]。不同風味火腿的形成與發酵過程中的優勢菌群有著密切關系[9]。在火腿長時間的發酵中，產品中的微生物種類和數量是一個不受控制的因素，直接影響著與風味形成有關的揮發性化合物的產生。在大多數火腿成熟過程中，微生物對火腿風味的形成有促進作用,并可以防止火腿的腐敗變質，延長保質期。但同時，一些致病菌和腐敗菌會在火腿表面產生毒素和黑斑，影響火腿的外觀和消費者的安全，給火腿產業造成十分嚴重的損失[10]。文章擬總結近年來有關火腿微生物的研究報道，綜述對火腿中微生物的多樣性以及有害微生物的研究進展，為火腿工業的現代化生產提供一些參考。

1 火腿微生物的多樣性

火腿中的主要微生物一般包括酵母菌、霉菌、細菌。這些微生物可能源于豬肉本身、食鹽[11]等發酵劑中，或者來源于工具、設備、加工環境[12]，也包括工人手上攜帶的微生物。根據腌制火腿的種類、其特定的生產工藝和環境條件，火腿中微生物的相對豐度有很大程度的差異。如肉的水分活度、pH值和營養物質的可利用性，發酵室溫度、壓力、相對濕度等都會對最終產品的微生物數量造成影響。

腌制火腿的微生物區系在不同加工階段會發生變化。由于酶活性不同，微生物區系對產品的口味、風味和顏色有影響，如脂解、脂質氧化、蛋白質水解、氨基酸降解以及硝酸鹽還原等。這些參數也很大程度上受到肉本身內源性酶的影響，如蛋白水解酶和脂解酶，其對火腿風味有很大影響。

1.1 酵母菌

由于加工環境的原因，新鮮豬腿肉中會在表面存在一些酵母菌，其數量隨加工階段發生變化。Núez等[13]從制作Iberian火腿的豬腿肉中測得其表面酵母活菌數低于104CFU/g，在鹽漬后階段增加至最高，約107CFU/g。在發酵階段，酵母菌種類進一步增加，誕沫假絲酵母菌(C.zeylanoides)在西班牙火腿成熟前期占主要地位,漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和深紅酵母(Rhodotorularubra)是成熟后期的優勢菌種,同時還有少量的布朗克假絲酵母(C.blankii)、中間假絲酵母(C.intermedia)和卡氏畢赤酵母(Pichiacarsonii)。在完全成熟的火腿中，德巴利酵母菌屬和念珠菌屬[14]是優勢菌群，其中包括馬拉馬氏酵母(D.marama)、漢遜德巴利酵母和誕沫假絲酵母[15]。Simoncini等[16]在西班牙火腿中鑒定出了漢遜德巴利酵母、馬拉馬氏酵母和誕沫假絲酵母菌；在發酵過程中也檢測出了少量的無名假絲酵母(C.famata)和生絲畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)；偶爾也檢測出了鏈狀假絲酵母(C.catenulata)、季也蒙假絲酵母(C.guilliermondi)和隱球菌(Cryptococcus)等。根據Simoncini等[16]的試驗結果，漢遜德巴利酵母在意大利火腿中并不是優勢菌，與西班牙火腿相比，意大利火腿中有更多種類的酵母菌。

酵母微生物會對干腌火腿的風味產生影響。Martín等[17]將從干腌火腿上篩選分離得到的漢遜德巴利酵母接種至豬排上，采用固相微萃取(SPME)纖維收集揮發性化合物進行GC/MS分析，結果顯示接種漢遜德巴利酵母更有利于復合醇的形成。Andrade等[18]從Iberian火腿中分離出117株酵母菌，其中大部分為漢遜德巴利酵母和誕沫假絲酵母菌；并比較了空白對照組和接種漢遜德巴利酵母和誕沫假絲酵母菌的試驗組之間所產生的揮發性化合物的差異，結果顯示支鏈醛、醇和酮有著明顯的不同，其中接種漢遜德巴利酵母的試驗組中與干腌風味有關的化合物含量最高，例如3-甲基丁醛。黃艾祥[19]將從云腿上篩選到的優勢菌誕沫假絲酵母作為發酵菌種，發酵液中天冬氨酸和組氨酸含量增加，無內源酶的情況下，微生物能使火腿肌肉蛋白質降解，說明酵母微生物對火腿風味品質特征形成有促進作用。

1.2 霉菌

干腌火腿的真菌群落通常位于肉的表面，主要取決于發酵室中的空氣、溫度、相對濕度和肉的水分含量，生肉中的原始微生物群的作用不大[12]，與細菌相反，霉菌在成熟過程中的多樣性增加。Comi等[20]從San Daniele火腿中分離出的霉菌主要是曲霉屬、青霉屬和散囊菌屬。Iberian火腿上鹽后，青霉屬(Penicillium)是優勢霉菌，特別是普通青霉菌(P.Commune)[21]和產黃青霉菌(P.chrysogenum)[22]。Battilani等[23]從意大利火腿表面和發酵室中同時檢測出了大量的納地青霉(P.nalgiovense)，其占青霉屬總量的60%。Monte等[15]在干腌火腿中檢測出了木霉，尤其是綠色木霉，同時在長期貯藏的火腿中檢測出散囊菌屬，包括蠟葉散囊菌(E.herbariorum)和匍匐散囊菌(E.repens)。母雨等[24]通過對中國盤縣火腿微生物多樣性分析發現，曲霉菌屬和青霉菌屬是優勢霉菌。賀稚非等[25]從金華火腿表面分離出多種霉菌,所鑒定的優勢霉菌均為半知菌類叢梗孢目,其中鑒定出青霉屬中有意大利青霉、簡單青霉，曲霉屬中有米曲霉、灰綠曲霉和薩氏曲霉,還有卡地干酪青霉、柑橘青霉等。黨喜軍[26]在研究鄧諾火腿表面微生物多樣性時發現，霉菌中分離的優勢菌群為曲霉屬，曲霉屬在3年和4年火腿中最高，發酵后期對風味的形成及防腐起主要作用。

霉菌屬于好氧菌,這類微生物往往存在于發酵食品的表面。霉菌繁殖會形成菌絲體，可在發酵肉制品表面形成一層“保護膜”,同時霉菌可以分泌蛋白酶與脂肪酶,在酶的作用下，蛋白質和脂肪生成游離的氨基酸和脂肪酸,為發酵肉制品增添芳香風味，同時菌絲體也可以阻止外界污染物的入侵。Alapont等[27]通過研究干腌火腿和發酵室中真菌的種類，檢測出74株真菌，其中大多數具有脂解活性(94.59%)，39株(52.70%)表現出對酪蛋白的水解活性，表明真菌在干腌火腿發酵過程中發揮著重要作用。Ockerman等[28]從西班牙火腿表面分離出5株青霉屬霉菌，用于制備西班牙傳統肉制品發酵劑。通過試驗驗證，發現對風味品質的影響主要取決于接種的菌株和培養溫度。當溫度高于3 ℃時，接種兩株產黃青霉的火腿風味品質下降，但接種金黃色青酶(P.Aurantigriseum)和卡地干酪靑霉(P.Camemberti)菌株的火腿在3～8 ℃的溫度下風味質量提高，但在溫度高于12 ℃時風味質量降低。以上結果均表明，火腿風味物質的形成與接種霉菌的種類是相關的，但也有學者認為霉菌與火腿風味之間并無直接關系。林克忠等[29]研究發現，金華火腿的品質和火腿香氣形成與火腿在發酵期所生長的各種霉菌沒有直接關系,在發酵階段采用人工方法嚴格控制霉菌生長的情況下同樣可生產出色香味俱佳的優質火腿，但是許多霉菌對腐敗細菌有抑制生長作用，表面霉菌可以防止火腿過度氧化,避免火腿在漫長的發酵階段(3～7月份)不會腐敗變質和氧化變味,從而保證金華火腿能在自身腿肉中的各種固有酶類的催化下,分解肌肉中的蛋白質和脂肪,形成金華火腿所特有的色香味。因此霉菌對金華火腿的質量和香氣的形成有著間接的作用。

1.3 細菌

細菌的種類和數量在干腌火腿成熟的過程中會發生很大的變化，并且隨著成熟時間的延長，細菌數量和種類會減少。Hinrichsen等[30]在對Parma火腿的檢測中發現，鮮肉中好氧活菌數大約為107CFU/g，發酵期結束后，好氧活菌數減少至103CFU/g。Rodríguez等[31]和Lorenzo等[32]分別對意大利和西班牙火腿發酵過程中的細菌種類變化進行了研究，發酵初始階段，意大利和西班牙火腿的表面微生物主要是革蘭氏陰性菌、腸桿菌、微球菌和棒狀桿菌；發酵過程中，微球菌(Micrococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus)數急劇增加，125 d后幾乎占可培養菌群的100%。氯化鈉是火腿腌制過程中的重要添加劑，對火腿中微生物種類有很大影響。Cordero等[11]研究了西班牙火腿所使用的食鹽中的微生物含量，發現分離出的微生物中60%為葡萄球菌,25%為微球菌，6%為考克氏菌(Kocuria)，5.4%為皮生球菌(Dermacoccus)，0.5%為口腔球菌(Stomatococcus)。出于對健康的考慮，世衛組織呼吁應減少食品中的鈉含量，氯化物類復配鹽(鉀、鈣、鎂)是目前在火腿低鹽研究中采用較多的食鹽替代物[33]。Blesa等[34]研究了低鈉對火腿中微生物的影響(研究批次之間的好氧活菌和腸桿菌數無差異)。結果表明，隨著貯藏時間的延長，乳酸菌數量增加更為明顯，而對金黃色葡萄球菌的抑制作用則較低。

乳酸菌是火腿發酵過程中十分重要的菌種，其能產生乳酸、細菌素等,具有抑制火腿中病原微生物的生長和毒素的產生,并且可以減少發酵制品中亞硝胺的生成[35],提高產品的安全性、縮短生產周期[36]。葡萄球菌經常從肉制品中分離出來，通常被用作香腸生產中的發酵劑。通過對木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)基因組的分析以及在肉模型中的原位表達[37]，發現該菌可很好地利用不同的肉基質作為碳源和氮源，可以通過激活硝酸還原酶活性增加腌制肉制品的典型顏色，有助于提高產品感官特性；同時可促進丙酮酸和氨基酸的分解代謝，增加風味化合物含量，并且可以限制脂肪酸氧化，從而避免酸敗。母雨等[38]將木糖葡糖球菌和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)作為發酵劑，考察不同微生物對火腿發酵的影響，通過HS-SPEM-GC-MS技術檢測到接種發酵劑火腿中醛、醇、酸、酚類物質的種類和含量均明顯提高，而烴類和醚類物質含量顯著降低，改善了火腿的風味品質。于海等[39]在干腌肉塊上接種表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、木糖葡萄球菌和耳氏葡萄球菌(Staphylococcusauricularis)，通過固相微萃取(SPME)和氣相色譜—質譜聯用(GC-MS)對干腌肉塊中揮發性風味化合物進行測定，發現接種表皮葡萄球菌的發酵肉塊中雜環類化合物相對含量較高,接種木糖葡萄球菌的發酵肉塊中醛類物質相對含量較高，接種耳氏葡萄球菌的發酵肉塊中酯類物質相對含量較高，表明接種優良的菌種對干腌肉制品風味的形成有良好的促進作用。

2 微生物對火腿安全性的影響

干腌火腿加工時間長，除食用鹽外，不添加任何防腐劑，只在微生物的作用下成熟。在發酵室中,火腿表面和內部會有大量的微生物自然生長,對干腌火腿食用安全性具有很大的隱患。研究表明，部分霉菌的生長對火腿整體品質的提高發揮著積極作用[40]，但有些霉菌產生真菌毒素，對干腌火腿的安全性構成很大的威脅[41]。除霉菌外，火腿表面也可能存在致病菌，如金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特菌，并在國外發生過食物中毒的事件[42]。

2.1 真菌毒素

在大多數食品中霉菌被認為是產生腐敗的原因[43]。霉菌毒素是潛在的危害人體健康的次生代謝產物，其中毒性最強的真菌毒素之一——赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA),被世衛組織列為II類致癌物[44]，脊椎動物食用后，表現出腎毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致畸作用[45]。盡管植物性食品容易受到OTA的污染[46]，但某些來源于動物的食品，如干腌肉制品，也被證明是導致人類攝入OTA的原因。Comi等[20]研究了San Daniele干腌火腿成熟過程中霉菌的生態及其毒性，從分離出的霉菌中發現了黑曲霉產OTA的潛力。Andrade等[47]將6.45 lg(CFU/cm2)青霉接種至干腌火腿切片上，在0.84aw下發酵15 d，OTA積累量達到42.93 μg/kg。Alapont等[22]對西班牙火腿加工過程中的霉菌菌落進行了分析，發現產黃青霉、普通青霉、波蘭青霉(P.polonicum)和疣孢青霉(P.verrucosum)可以產生OTA；74株真菌中有25株(33.7%)可以產生產氣莢膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens，CPA)。CPA能引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥以及人畜創傷性氣性壞疽[48]。Peromingo等[49]分別在干腌火腿和發酵香腸上接種了4.43 lg(CFU/cm2)產OTA的疣孢青霉，21 d后，火腿中OTA含量為1.09 μg/kg，香腸中OTA含量為0.71 μg/kg。除OTA外，研究人員將分離出的霉菌接種至培養基中，發現能產生多種毒素。Martín等[50]采用膠束電動毛細管色譜法(MECC)對20株常見于干腌肉制品中的霉菌產生的次生代謝產物進行了分析,檢測出20個霉菌中有10個產生霉菌毒素，包括環匹阿尼酸(cyclopiazonic acid)、霉酚酸(mycophenolic acid)、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1)、雜色曲霉毒素(sterigmatocystin)和灰黃霉毒素(griseofulvin)等。以上這些毒素都會對人體健康造成危害，需及時采取有效措施進行防治。

2.2 致病菌和腐敗菌

單核細胞增生李斯特菌是一種常見于食品加工環境中的嗜冷微生物，其引起的李斯特菌病[51]是最嚴重的食源性疾病之一，具有高發病率、住院率和死亡率的特點。尤其在老人、孕婦和嬰兒中，這種細菌造成的危害更嚴重。Prencipe等[52]對帕爾馬火腿生產線中的微生物進行了研究，在3%的豬胴體、12.5%的生火腿和2%的最終產品中發現了單核細胞增生李斯特菌。Giovannini等[53]報告了干腌帕爾馬火腿和San Daniele火腿的單核細胞增生李斯特菌的檢出率為4%。這種生物能在廣泛的溫度和pH值范圍內生長，并且能耐受水分活度為0.90～0.92和16%的NaCl濃度；因此，如果存在生火腿中會影響最終產品的質量安全。

火腿上抹鹽的目的是為了抑制微生物的生長，加快水分流失。但是,耐鹽能力強的葡萄球菌常成為發酵火腿中的優勢菌群，而金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的致病菌，可引起食物中毒。Utumann等[54]曾在1992年報道德國由于食用煙熏的干腌火腿引發人食物中毒事件。Susana等[55]對美國傳統干腌火腿進行了金黃色葡萄球菌的接種存活試驗,金黃色葡萄球菌數隨加工時間的增長而減少,但95 d后的存活數仍達104CFU/cm2,178 d 后才未檢出。發酵階段可檢測出金黃色葡萄球菌，而成熟火腿中是否存在金黃色葡萄球菌有待進一步驗證。金黃色葡萄菌球菌在6.7～47.8 ℃能耐受的最低水分活度為0.83～0.86，當水分活度高于0.88時，其在10～46 ℃均可以產生腸毒素[56]。

干腌火腿腐敗變質最重要的原因之一是“骨污染”，或稱為“深度變質”[57]。這種現象最常見于鄰近骨骼的大肌肉團，其內部產生難聞臭味。多數情況下，這種變化對火腿外觀的影響較小，在發酵階段常被忽視。García等[58]對“骨污染”干腌火腿的微生物種群和揮發性化合物進行了評估，發現在“骨污染”火腿與正常火腿中，腸桿菌數存在極顯著差異(P<0.01)，“骨污染”火腿中的揮發性物比未變質火腿中的酮類、醇類和酯類含量高，可能是由上述細菌的微生物代謝引起的。普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)是導致干腌火腿腐敗的最重要微生物。液化沙雷氏菌是肉類加工工業中在機械表面發現的最常見微生物之一[59]，說明雖在成品中檢測到“骨污染”，但腐敗本身在加工的第一階段就開始了[60]。這種缺陷的發生與切割、運輸或修整、上鹽階段的溫度過高有關[61]。此外，高溫發酵階段，由于食鹽滲透較低或者火腿水分活度過高，都會降低腐敗菌的抑制作用。

3 干腌火腿微生物發酵劑

在古老的傳統干腌火腿制作中，人們將一定量已用過的鹽水轉移到新鹽水中，以保持不同批次火腿間保持一致的風味。然而，該方法的成功與否在很大程度上取決于衛生情況，污染風險相當高。現代干腌火腿加工中的一項創新是使用發酵劑。發酵劑可以由單個菌株或不同種類微生物的多個菌株組成，使用發酵劑的優勢是標準化發酵時間和標準化的產品質量。此外，發酵劑的加入可以抑制病原菌和腐敗菌生長而不改變最終產品感官特性。

長時間發酵的火腿(如伊比利亞火腿)加工過程中的環境條件也適合有害微生物群落的生長，例如，赭曲霉毒素A(OTA)常在西式發酵火腿中被發現，通常由青霉屬菌株產生。Acosta等[62]致力于篩選能形成抑制產毒霉菌生長的抗真菌蛋白的青霉屬菌株，從281株經篩選的菌株中鑒定出一株產黃青霉，該菌株能產生抗真菌蛋白，并且可作為抑制產毒霉菌生長的保護性發酵劑。Andrade等[47]篩選出作為發酵劑的適合酵母菌株，評估了10種漢遜德巴利酵母菌株在不同的aw值下抑制北歐青霉生長和OTA產生的能力，發現漢遜德巴利酵母FHSCC 253H可以作為保護性發酵劑，該菌株與北歐青霉共培養時可以降低北歐青霉產OTA的水平，在aw值為0.94 時觀察到了最高的抑制作用，推測這種酵母發酵劑最好用于發酵的前期，因為此時火腿的水分活度較高，可以起到更好的抑制效果。Simoncini等[63]在西式發酵豬肉模型系統中研究了能產生OTA的北歐青霉和漢遜德巴利酵、伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)之間的競爭，發現其中一種酵母與北歐青霉同時接種，與對照組相比，北歐青霉減少了1～3 lg(CFU/g)。此外，漢遜德巴利酵母147在模型系統中顯示出最佳的拮抗活性，且能顯著降低西式發酵火腿中OTA的水平。因此，這種菌株可能是一個很有前途的候選保護性發酵劑，可以提高干腌火腿的安全性。

4 結論

霉菌、酵母菌、細菌對火腿風味的產生起著重要的作用。不同品牌的火腿，微生物的種類和數量有著明顯的不同，這可能是造成火腿不同風味特征的原因。加工環境或者原料腿本身，也會將有害微生物引入到發酵過程中。這些微生物中有害微生物會導致火腿腐敗或在表面產生黑斑，影響火腿的質量，有些有害微生物還會產生真菌毒素，嚴重威脅到消費者的生命安全。火腿發酵劑是目前研究的熱點，發酵劑可以保持產品風味的穩定，減少火腿中真菌毒素的積累，這對食品安全是特別必要的。但是目前中國火腿生產仍采用自然發酵，微生物發酵劑的應用并未普及，微生物的不確定性可能會給火腿企業造成嚴重的損失。因此，從火腿發酵的不同時期分離出優勢微生物并不局限于成熟階段，不同時期的優勢微生物對有害菌的抑制和風味的促進作用不盡相同，不同時期有目的性地針對使用微生物發酵劑可成為未來火腿行業突破的重要方向。