LncRNA調控PDLSCs成骨分化的研究進展

孫唯夫，劉 佳，金作林

牙周炎是發生在牙周組織的感染性疾病,主要表現為牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動脫落。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是一種可以從牙周組織分離出的間充質干細胞,具有分化成多種細胞的潛能,包括成骨、成脂、成纖維和成牙骨質等譜系的細胞[1-2]。由于PDLSCs便捷的組織來源和良好的成骨能力,它被視為牙周組織改建和修復的種子細胞[3]。然而炎癥微環境會破壞PDLSCs的多向分化潛能尤其是成骨分化能力[4]。近些年發現的LncRNA是一類重要的參與炎癥反應的非編碼RNA, LncRNA可以在炎癥微環境下調控PDLSCs的成骨分化,為利用LncRNA治療牙周炎導致的牙周組織喪失提供了依據[5]。

1 PDLSCs的生物學特性

1.1 PDLSCs是牙周組織改建和修復的關鍵細胞

2004年,Seo等利用單細胞克隆技術,首次從牙周膜分離并命名了 PDLSCs,這類細胞屬于間充質干細胞[1]。其良好的成骨能力可以修復因炎癥喪失的牙槽骨,進而軟組織附著改建,起到牙周組織修復的作用[3,6]。干細胞療法是一種具有很大潛力的牙周組織修復方法,有廣闊的臨床應用前景[7]。Li等成功將人PDLSCs植入裸鼠的牙周組織,并確定了移植后的有效性和安全性[8]。Iwata使用自體來源的PDLSCs膜片對患者進行牙周組織缺損的治療,取得顯著效果[9]。這些結果都說明PDLSCs在牙周組織的功能維持和缺損組織修復中起到重要的作用。

1.2 炎癥對PDLSCs功能的影響

在PDLSCs增殖分化的過程中,凡影響細胞微環境的因素都將破壞PDLSCs的正常功能[10]。在炎癥微環境中,PDLSCs會失去成骨潛能,即使脫離炎性微環境,其功能缺失仍然是長期的、不可逆的[4],這與腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α的增高有關[11]。炎癥中被高度活化的經典Wnt通路和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路以及炎性因子白細胞介素1(Interleukin-1, IL-1)和IL-6也會抑制炎癥環境中PDLSCs(iPDLSCs)的成骨分化[12-14]。有學者正致力于研究同種異體間充質干細胞治療疾病的可行性,保留拔除的正畸牙和阻生牙,建立PDLSCs細胞庫以供臨床實驗和治療[9],但目前如何獲得狀態良好的自體PDLSCs是亟需解決的問題。

2 LncRNA的分子生物學作用

LncRNA是一類核苷酸序列大于200的非編碼轉錄物質,在維持細胞和組織穩態中起重要的調節作用。LncRNA含有模塊結構域,通過二級結構或堿基配對的方式與蛋白質、核酸結合,與其它物質相互作用而調節生物體眾多的生理過程,包括X染色體失活、干細胞多能性和基因組印記等；同時,它也與眾多病理過程有著密切的聯系,尤其是炎癥反應[15-16]。

LncRNA在生長發育及干細胞分化中起著重要作用。女性生長發育的過程中,兩條X染色體中會有一條發生失活稱為X染色體失活。LncRNA XIST(X染色體失活特異轉錄物)可將組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶募集到X染色體上,導致組蛋白甲基化和一條X染色體的沉默[17]。在多能干細胞中,反向編碼的LncRNA調節臨近基因的轉錄,影響多能干細胞的分化。反向的LncRNA Evx1as促進其鄰居基因EVX1的轉錄,調節中內胚層分化[18]。

LncRNA在免疫細胞發育、分化和活化的過程中廣泛表達,其既可以作為轉錄調節因子,也可以通過影響其它因子來調節免疫基因的表達,參與免疫調節[19-20]。NF-κB相互作用的LncRNA(LncRNA NKILA)可以抑制血管炎過程中NF-κB/KLF4正反饋回路的活性,起到分子開關的作用,減輕炎癥反應[21]。TNF-α和hnRNPL相關免疫調節LncRNA(LncRNA THRIL)在許多人體組織中表達,它與可變剪切因子特異性結合異質核核蛋白L(hnRNPL)形成THRIL-hnRNPL復合物,作用于TNF-α的啟動子來調節其轉錄,影響炎癥反應。同時THRIL的表達與川崎病(病理表現為全身性血管炎)癥狀的嚴重程度密切相關[22]。綜上所述,LncRNA與眾多的生理過程有密切的聯系,對炎癥等病理過程也起關鍵的調控作用,研究其作用機制對于牙周病患者的口腔治療具有顯著的臨床意義。

3 LncRNA調控PDLSCs成骨分化的作用機制

牙周炎對患者最大的損傷就是牙槽骨喪失,這會加重牙周袋形成甚至造成牙齒松動、脫落,而且牙周炎得以控制后,缺損的牙周組織也無法自行恢復。部分口腔醫生現致力于利用PDLSCs的成骨能力修復牙槽骨,進而軟組織附著、改建,恢復牙周組織正常形態,達到牙周組織再生的治療目的[7]。LncRNA已被證明對干細胞成骨分化具有重要影響,兩者的關系逐漸成為研究的熱門[23]。

3.1 LncRNA調控正常PDLSCs的成骨分化

PDLSCs是一種間充質干細胞,具有分化成多種細胞的潛能,在體外培養條件下可以分化為成骨、成脂、成纖維和成牙骨質等譜系的細胞,并且其分化過程受多種因素的調控[10]。在PDLSCs成骨分化前后,有2 171種LncRNA差異表達,很大一部分LncRNA對成骨分化起著調控作用[23]。Gu等發現編碼為TCONS_00212979和TCONS_00212984的LncRNA作為內源競爭RNA (competing endogenous RNA, ceRNA), 與mRNA競爭微小RNA(MicroRNA, miRNA) 34a和146a的結合位點,通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調節PDLSCs的成骨分化。同時也提出了LncRNA-miRNA-mRNA調控網絡,為以后深入地研究機制奠定了基礎[24]。

部分LncRNA抑制了PDLSCs的成骨功能：LncRNA MEG家族與PDLSCs的成骨分化關系密切,MEG8、MEG3和MIR22HG都抑制PDLSCs的成骨分化,其中MEG3通過與BMP2的mRNA競爭hRNPI來降低BMP2水平而起作用[23,25]。Jia等研究發現,下調LncRNA ANCR能抑制經典Wnt通路,促進PDLSCs的成骨分化,ANCR本身具有抑制成骨的作用[26]。其中一種機制是LncRNA ANCR直接作用于miRNA-758來降低其對Notch的抑制作用,進而興奮經典的Wnt通路,下調ANCR會抑制Wnt通路[27]。ANCR對于經典Wnt通路是否存在其它作用機制有待進一步的研究。有學者研究發現RNA結合蛋白(RBP) Lin28A上有多個牛磺酸上調因子-1 LncRNA(LncRNA TUG1)的結合位點,TUG1與其相互作用的結果抑制了PDLSCs的成骨分化過程[28]。

同樣,研究者也發現具有積極作用的LncRNA：miR-106a-5p可以抑制PDLSCs的成骨分化,miR-106a-5p上存在LncRNA PCAT1的結合位點,PCAT1的過表達會抑制miR-106a-5p,上調miR-106a-5p的靶基因骨形態發生蛋白-2(BMP2)的表達[29-30],BMP2是一個重要的分化誘導因子,能激活Smad家族,促進PDLSCs的成骨分化和骨組織的再生[31]。不僅如此,miR-106a-5p的另一個靶基因E2F5可以促進PCAT1的表達,形成了一個針對BMP2的前饋調控網絡,該研究首次提出LncRNA-miRNA-細胞因子的前饋調控網絡[30]。Xu等通過慢病毒轉染的方法調節LncRNA TWIST1在PDLSCs中的表達,證實其可以促進PDLSCs的成骨分化[32]。

LncRNA通過多種途徑和方式調節PDLSCs的成骨分化,且涉及眾多分子,需要更多的研究來明確其機制。

3.2 LncRNA調控牙周炎環境下PDLSCs的成骨分化

LncRNA的表達與疾病的發展密切相關,研究LncRNA調控iPDLSCs成骨分化的機制對于應用自體PDLSCs進行干細胞治療具有重要意義。2014年,Zou等首次證明了慢性牙周炎組織中LncRNA與相鄰正常組織的表達存在差異[33],說明LncRNA在牙周炎的發病機制中有重要作用。LncRNA也與牙周炎的復發有關,高水平的LncRNA MORT可以降低牙周炎的復發率[34]。目前的研究發現一些促進iPDLSCs成骨分化的LncRNA。

炎癥作用下PDLSCs中存在大量差異表達的LncRNA和新出現的LncRNA,這些LncRNA與間充質干細胞的發育和分化有關,其中許多差異表達的LncRNA作為ceRNA與miRNA形成調控網絡,調節靶基因的蛋白質編碼,影響細胞的生物學功能[35]。Mir-182可通過Foxo1負性調節成骨分化[36],Wang等[5]發現LncRNA-poir、mir-182和Foxo1高度相關：在牙周炎環境下,LncRNA-poir通過競爭性抑制miRNA-182的表達,增強靶分子Foxo1的表達,Foxo1又與TCF-4競爭β-catenin來抑制經典Wnt通路,促進iPDLSCs的成骨分化,形成LncRNA poir- mir182- Foxo1的調控網絡。此外,炎癥中被高度活化的NF-κB通路會影響LncRNA-poir和mir-182調控網絡的平衡。

LncRNA ptcsc3是Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)4的上游抑制劑,通過下調TLR4間接調節牙周病原體的免疫識別,其過度表達會抑制iPDLSCs的增殖[37]。值得注意的是,ptcsc3和TLR4的表達水平僅與iPDLSCs顯著相關,而與正常的PDLSCs不顯著相關,因此ptcsc3和TLR4之間可能存在某些病理介質；而且在神經膠質瘤細胞中,ptcsc3可以抑制經典Wnt通路的活性,其在iPDLSCs中能否對Wnt通路起到同樣的抑制作用進而促進iPDLSCs成骨分化,這有待今后進一步的研究[38]。上文提到的LncRNA TWIST1對于iPDLSCs也起促進成骨分化的作用[34]。

綜上所述,在炎癥環境中,LncRNA對iPDLSCs的成骨分化有著重要的調控作用,運用LncRNA的調控作用改善iPDLSCs的成骨分化能力是臨床開展干細胞治療的潛在方法,但首先要將LncRNA的調控網絡研究得更加明確。

4 結 語

治療牙周炎造成的牙周組織喪失是臨床工作中的一大難題,目前利用組織工程學技術再生牙周組織是一種極具潛力的療法。作為間充質干細胞的牙周膜干細胞(PDLSCs)，因其多向分化潛能和自體源性而進入研究者的視野,逐漸成為研究熱點。它具有修復缺損牙周組織的能力,其中最重要的是成骨能力,但炎癥環境下的PDLSCs的成骨能力明顯下降,并且在脫離炎癥環境后也無法恢復。在臨床實踐中,醫生很難從牙周炎患者的口中取得健康的PDLSCs,恢復炎癥環境下PDLSCs的成骨分化能力并促進牙周組織再生是解決這一問題的關鍵。LncRNA已被證明在健康和炎癥環境下對PDLSCs的成骨分化都起著重要的調控作用,其機制復雜多樣,涉及的分子及信號通路廣泛且相互影響,尚未形成明確的理論體系,LncRNA可以作為關鍵的治療靶點進行研究。