14-3-3蛋白在口腔鱗癌中的表達與作用機制研究進展

李 媛，達林泰

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其惡性程度高、局部浸潤性強、易發生早期淋巴結轉移，淋巴結轉移情況是OSCC最主要的預后影響因素。從頭頸癌患者的五年存活率來看，無頸部淋巴結轉移(pN0)患者五年存活率為85.5%，無淋巴結結外擴散的頸部淋巴結轉移患者為62.5%，而有淋巴結結外擴散的頸部淋巴結轉移患者則降至29.9%[1]。腫瘤的侵襲轉移是多基因參與、多步驟完成的復雜過程。該過程涉及多種信號轉導通路，研究相關分子蛋白的表達情況對于闡明OSCC的發生發展機制具有重要意義。

14-3-3蛋白又稱酪氨酸3-加單氧酶/色氨酸5-加單氧酶激活蛋白，具有磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸(pSer/pThr)結合位點，通過與Ser/Thr磷酸化的細胞內蛋白相互作用，可參與細胞內信號轉導、細胞周期的調控、遷移、分化、凋亡等過程。研究發現14-3-3蛋白通過結合PI3K(磷脂酰肌醇-3激酶)的p85調節亞基并激活Akt[2](絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶)或使腫瘤抑制基因p53和p21失活來促進癌細胞的存活[3]。在Wnt5a/ROR1信號轉導通路中，14-3-3ζ促進慢性淋巴細胞白血病的遷移和增殖[4]。總之，癌癥中的14-3-3蛋白主要作為結合其磷酸化靶蛋白的銜接因子，以調節腫瘤的發生發展、轉移和侵襲。14-3-3蛋白的生物學功能廣泛，并與多個系統如消化系統、神經系統、泌尿系統等疾病以及腫瘤的發生有關，有研究報道14-3-3蛋白可能與OSCC的發生發展有關，本文對14-3-3蛋白的生物學功能及其與OSCC的發生發展關系作一綜述。

1 14-3-3蛋白概述

1.1 結構特征

14-3-3蛋白是在真核細胞中普遍表達、高度保守的酸性蛋白家族，“14-3-3”反映它們在二維DEAE-纖維素色譜和淀粉凝膠電泳中的特定遷移模式，分子量在28～33 ku之間，由不同的亞型組成，其種類在不同物種之間有所不同，在哺乳動物中存在7個亞型(α/β，γ，ε，ζ，η，σ和θ/τ)，由不同的基因編碼[5]。14-3-3蛋白幾乎存在于所有真核生物中，在細胞中多以二聚體形式存在，二聚體中的每個分子都含有獨立的分子配體結合通道，從而可以同時結合兩個磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸結合位點，除14-3-3σ外，所有14-3-3蛋白均可形成同源或異源二聚體；14-3-3蛋白是高度螺旋狀結構，每個單體含有九個反平行的α-螺旋(H1—H9)，其凹面為H3、H5、H7、H9兩親性配體結合溝，它是14-3-3蛋白與配體結合的結構基礎，同時也調節著14-3-3蛋白與配體中的磷酰氨基酸的相互作用[6]。由于14-3-3蛋白可以形成同源或異源二聚體，因此控制14-3-3蛋白二聚化或表達機制的失調可以改變14-3-3蛋白二聚體的平衡，這種不平衡可能破壞細胞穩態，導致14-3-3蛋白靶向途徑的激活，促進癌癥的發生。

1.2 生物學功能

14-3-3蛋白家族成員與多種蛋白質相互作用，包括轉錄因子、跨膜受體、生物合成酶、細胞骨架蛋白、信號分子、凋亡因子和腫瘤抑制因子，可對靶蛋白產生深遠影響，改變其定位、穩定性、構象、磷酸化狀態、活性，或阻斷靶蛋白對修飾酶(例如激酶、磷酸酶或蛋白酶)的可及性[7]等。因此，通過調節多種結合配偶體的功能，14-3-3蛋白已經成為許多重要細胞過程中的關鍵調節成分。人類14-3-3蛋白家族的七個成員通過與特定序列基序內含有磷酸化Ser/Thr殘基的信號蛋白形成蛋白質-蛋白質復合物來調節多種細胞信號傳導途徑，此外，它也可以識別未磷酸化的基序，進一步擴展了與之結合的蛋白譜，使其具有多樣性，從而參與多種細胞進程，包括細胞周期、細胞凋亡、代謝、基因表達的轉錄調控、DNA損傷反應等[8]。綜上，14-3-3蛋白的整體作用可分為三類：①穩定特定蛋白的構象或修飾；②調節酶的活性；③調節其靶蛋白的亞細胞定位。

14-3-3蛋白的不同亞型都有其特殊的功能。研究[9]發現14-3-3η幾乎僅定位于線粒體，14-3-3γ僅定位于細胞核，14-3-3β、θ、σ定位于細胞質和細胞核，14-3-3ε和ζ幾乎完全位于細胞質中。14-3-3σ是目前公認的腫瘤抑制分子，14-3-3σ編碼基因的甲基化使其基因沉默，導致14-3-3σ蛋白在腫瘤細胞中持續低表達，會對p53產生負性調節作用并在DNA損傷后維持上皮細胞的G2/M期檢測，從而促進腫瘤細胞的增殖生長[10]。而14-3-3γ是通過阻斷p53的抑制劑并與它的調節蛋白相互作用來調節p53。14-3-3ζ在乳腺癌、肺癌、肝癌、頭頸癌等惡性腫瘤中有表達，它通過與靶蛋白的相互作用，激活或抑制對靶蛋白的修飾，調節靶蛋白的活性[11]。目前的研究中，14-3-3η在類風濕關節炎[12]、腦部腫瘤[13]及心肌細胞[14]中的報道較多。在肝癌標本中，在瘤細胞和瘤內血管中觀察到14-3-3η的過度表達，其促進了細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化，阻斷14-3-3η或ERK1/2抑制了腫瘤的生長[15]。14-3-3β在腫瘤細胞增殖和凋亡中的具有重要作用，過表達14-3-3β的細胞中觀察到各種信號通路的增強激活，包括MEK/ERK級聯反應、PI3K/Akt/NF-κB途徑等，從而促進癌癥的侵襲和轉移[16]。研究表明14-3-3θ是一種新型的腫瘤抑制因子，可以作為轉移性乳腺癌新療法的候選預后生物標志物和靶標[17]。14-3-3ε是14-3-3蛋白家族中最保守的成員，它已顯示在許多腫瘤中上調并起到癌基因的作用[18]。由此可見，14-3-3蛋白家族的每個成員在癌癥發生發展過程中具有重要的生物學功能。

2 14-3-3蛋白參與癌癥的機制

2.1 14-3-3蛋白與細胞增殖

不受調控的細胞增殖是腫瘤發生的早期步驟，14-3-3蛋白與具有致癌潛力的各種蛋白質相互作用，包括成員Raf激酶家族[19]。正常細胞增殖通常由細胞表面受體酪氨酸激酶(RTK)啟動，Raf蛋白是RTK途徑中的關鍵信號傳導中間體，在靜息狀態下，14-3-3蛋白二聚體通過與Raf蛋白的N—和C—末端位點的結合，維持Raf單體在胞質中處于無活性狀態；當發出增殖信號時，14-3-3與Raf的C—末端位點的結合以Ras依賴性方式促進Raf二聚化；14-3-3蛋白與N—末端位點的結合可還抑制Raf激活，起正調節作用。Raf還可以通過突變激活促進異常細胞增殖，其依賴于14-3-3蛋白與C-末端位點的結合，進一步證明14-3-3蛋白在Raf調控中的重要性。

另一種作為細胞增殖關鍵調節因子的途徑是Hippo途徑，通過限制增殖和促進細胞凋亡有助于腫瘤的抑制[20]。在經典的Hippo途徑中，Lats激酶在YAP/TAZ上產生磷酸化依賴性14-3-3結合位點，磷酸化的YAP/TAZ通過與14-3-3蛋白結合將它們隔離在胞質中而使YAP/TAZ的促增殖功能失活，從而阻止它們進入細胞核與TEAD轉錄因子相互作用。

在細胞周期中，準確的染色體分離依賴于有絲分裂過程的精確調控。微管抑制劑破壞有絲分裂進程并激活有絲分裂檢查點，導致有絲分裂停滯。某些細胞甚至在不適應有絲分裂檢查點的情況下也退出了有絲分裂停滯期，稱為適應或滑移，并以非整倍性存活，這隨著有絲分裂檢查點缺陷的存在而增加，并且還可以促進腫瘤發生。研究顯示[21]，14-3-3η的表達缺失會增加有絲分裂細胞的凋亡，從而導致對微管抑制劑敏感和抑制非整倍體形成。當HCT116(人類結腸癌細胞系)和U87MG(人類膠質母細胞瘤細胞系)細胞中的14-3-3η減少，并與微管抑制劑聯合使用時，它使兩種癌細胞系對微管抑制劑敏感。這些結果表明，有絲分裂進程可能需要14-3-3η，并且可以將其與微管抑制劑一起視為一種新型的抗癌策略。

2.2 14-3-3蛋白與細胞遷移

在癌癥進展中，腫瘤細胞轉移的關鍵特性是遷移能力，細胞遷移的第一步涉及肌動蛋白細胞骨架的重塑，越來越多參與該過程的蛋白質被鑒定為14-3-3結合配體，激酶(如PKD、Par1b等)在肌動蛋白上產生磷酸化結合位點，從而與14-3-3蛋白結合，抑制這些肌動蛋白的調節功能[7]。在乳腺癌的進展中，14-3-3ζ作為調節TGF-β途徑的分子開關，其從早期的腫瘤抑制因子轉變為晚期轉移的啟動子。這種變化是由于14-3-3ζ分別與癌前細胞和癌細胞中的YAP1和β-TRCP結合。靶向14-3-3ζ作用于YAP1和β-TRCP的殘基可以預防由TGF-β途徑功能障礙引起的癌癥和轉移[22]。

Han等[23]和Santoro等[24]報道，14-3-3β過表達可以促進小鼠胚胎成纖維細胞系NIH 3T3細胞發生遷移，并通過與整合素(integrin)β家族的共定位 (colocalization)作用，調節細胞粘附，可能在增加腫瘤的侵襲性和運動性上起到相應作用，研究發現，14-3-3蛋白含有一個新的與整合素β家族相互作用的結合位點，因此，絲氨酸的磷酸化或許會阻斷14-3-3β與胞質中整合素的相互作用，從而促進細胞信號傳遞和遷移。

2.3 14-3-3蛋白與上皮-間充質轉化

上皮-間充質轉化(EMT)是另一種促進癌癥進展的生物學過程，在EMT期間，上皮細胞獲得間充質細胞的特性，其包括形態學變化、細胞極性喪失、間充質標記物的表達以及侵入和遷移的能力。因此，EMT的一個基本特征是E-鈣粘蛋白和其他抑制細胞運動的細胞粘附分子的下調。Snail轉錄抑制因子可作為EMT事件的主要調節因子，直接調節影響細胞粘附、運動和極性的基因[25]。14-3-3蛋白與EMT調節因子Snail在pT177位點的結合正調節Snail/Ajuda阻遏物復合物，從而下調E-鈣粘蛋白的表達[26]。劉顏等[27]的研究結果顯示，14-3-3ζ和aPKC-在膽管癌中協同表達，其表達水平與腫瘤分化程度及TNM分期密切相關，14-3-3ζ和aPKC-與E-cadherin表達呈負相關，提示14-3-3ζ和aPKC-可能通過EMT過程促進膽管癌的侵襲轉移。調查ErbB2在乳腺癌進展中功能的研究也揭示了14-3-3蛋白作為EMT調節劑的作用，ErbB2和14-3-3ζ的過表達改變了細胞進程，通過促進EMT降低細胞-細胞粘附，增加了正常乳腺上皮細胞的侵襲性質[28]。

3 14-3-3蛋白在OSCC中的表達與作用

口腔癌絕大多數為鱗狀細胞癌，發生于舌、頰、口底、唇、牙齦等，OSCC的發生通常經歷由正常上皮→上皮單純性增生→上皮異常增生→癌→轉移癌的過程?？谇话┌l病率高，且浸潤和轉移出現較早，很多患者就診時已成為晚期。研究口腔癌轉移過程中相關信號通路的作用和調節因子的表達對其診斷和治療具有重要的臨床意義。

Ralhan等[29]使用iTRAQ標記技術結合多維LC-MS/MS分析，將頭頸部鱗狀細胞癌蛋白質表達譜與非癌性頭頸組織(對照)進行比較，顯示14-3-3ζ在惡變前的口腔損傷及口腔鱗狀細胞癌中較正常口腔上皮組織中均呈現高表達。另有研究顯示，在非轉移性(SCC4及HSC2)和轉移性(Tu167及MDA1986)口腔癌細胞系中，無論在mRNA還是蛋白水平，14-3-3ζ在轉移性細胞系中呈現較高表達[30]。另外，已經確定了287個14-3-3ζ的結合配偶體，表明14-3-3ζ參與調節口腔癌細胞周期、增殖、凋亡、細胞運輸和內吞作用的蛋白質網絡，并且在口腔癌的進展和轉移中發揮重要作用。14-3-3σ由于其在調節p53和在DNA損傷后介導G2/M檢查點中的積極作用，因此被認為是腫瘤抑制因子，在許多上皮來源的腫瘤中觀察到14-3-3σ的下調。此外，在OSCC中發現14-3-3σ的表達具有角化作用傾向，但沒有與角化作用特異性相關[31]。

Jin等[32]在研究中發現舌癌細胞中14-3-3ζ表達增加，14-3-3ζ的過表達促進細胞增殖和遷移，同時通過調節FOXO3a轉錄因子抑制細胞凋亡，與腫瘤T分期、淋巴結轉移和舌鱗狀細胞癌(TSCC)預后不良有關。另一項研究表明，14-3-3ζ與NF-κB、β-catenin和Bcl-2結合，進而參與細胞信號傳導，導致口腔癌細胞增殖[33]。14-3-3ζ在OSCC癌組織中過表達，其敲低導致促炎細胞因子的表達升高，Stat3與14-3-3ζ直接相互作用，其破壞減輕了腫瘤炎癥中14-3-3ζ引起的抑制作用，表明14-3-3ζ可通過OSCC中的Stat3信號傳導調節腫瘤炎癥和免疫應答[34]。Chauhan等[35]對口腔癌前病變及OSCC進行蛋白質組學分析也顯示14-3-3ζ的顯著過表達，將其作為生物標志物，構成了OSCC患者的預后分子標志，并開發出風險預測模型，對建立OSCC患者的個性化治療具有良好的臨床適用性。在OSCC中hnRNPD相關蛋白網絡的研究中，證實了hnRNPD與14-3-3ζ，hnRNPK和S100A9蛋白質相互作用，參與多個細胞過程：DNA修復、復制、染色質重塑、細胞增殖、RNA剪接和穩定性，hnRNPD表現出與OSCC臨床標本中的14-3-3ζ表達顯著相關[36]。

14-3-3蛋白是細胞內重要的抗凋亡蛋白。細胞的凋亡過程中起關鍵作用的是凋亡信號調節激酶1(ASK1)。其中，14-3-3蛋白家族各成員均能與ASK1結合并控制其功能，且以14-3-3ζ最為常見。研究[37]發現14-3-3蛋白對ASK1控制的主要形式是14-3-3蛋白與ASK1共同表達，以抵消ASK1的促凋亡作用。另外，14-3-3蛋白還能結合磷酸化的促凋亡蛋白Bad，使其錨定在細胞漿內，不能與蛋白分子Bcl-2結合，進一步抑制凋亡活化因子細胞色素C(CytC)的釋放，最終抑制細胞的凋亡[37]。另有研究[38]通過組織微陣列免疫組化評估了214例頭頸鱗狀細胞癌病例中的ING4表達，發現HNSCC中ING4的細胞質表達顯著增加，并且與淋巴結轉移和14-3-3η表達顯著相關，結果表明細胞質ING4的增加可能是由于14-3-3η結合所致，也可能參與了惡性進展。

通過以上實驗研究和臨床觀察，表明14-3-3ζ和σ亞型在OSCC組織中都呈陽性表達，它們與OSCC的惡性生物學行為密切相關。所以，研究14-3-3蛋白在口腔鱗癌發生發展和侵襲轉移中的關系，可以運用到腫瘤治療中。

4 14-3-3蛋白與OSCC的靶向治療

目前口腔癌的綜合序列治療取得了較大的進展，提高生存率及生存質量仍是當今研究熱點。14-3-3蛋白參與致癌和抑癌基因的調控在探索新分子靶標與多靶向療法的研發，具有潛力，有些研究已視14-3-3蛋白為研發新型抗癌藥物的靶標[39]。有研究證明了GSK3β/β-catenin信號通路在調控14-3-3σ對舌癌細胞化療敏感性方面具有重要作用，作為一種負反饋機制，β-catenin/ZEB1增強了14-3-3σ啟動子的甲基化水平，從而下調舌癌細胞中14-3-3σ的表達，表明采用下調14-3-3σ的新策略可以增強化學治療舌癌的臨床療效[40]。在以14-3-3ζ為靶標的被siRNA轉染的頭頸癌細胞中顯示出G2-M停滯，通過誘導細胞凋亡，下調14-3-3ζ可使頭頸癌細胞對化療藥敏感[41]。

對于有效的口腔癌治療，可著手干擾14-3-3蛋白與靶蛋白的相互作用，合成天然抑制劑，例如通過與幾種參與細胞凋亡的蛋白(Bad、FKHRL1和ASK1)結合而成為調節信號傳導的效應物，文獻報道guggulsterone(GS，一種法尼醇X受體拮抗劑)靶向14-3-3ζ相關細胞通路，減少頭頸癌中的細胞增殖和誘導細胞凋亡[42]。有研究[43]發現巰氧吡啶鋅(PYZ)是抑制OSCC細胞體外增殖和誘導細胞凋亡的最有效的細胞毒劑，用PYZ治療可降低劑量依賴性的口腔癌細胞集落形成、遷移和侵襲能力，還可以降低14-3-3ζ、14-3-3σ、細胞周期蛋白D1、c-Myc和丙酮酸激酶M2(PKM2)的表達，抑制AKT/mTOR和Wnt/β-catenin誘導細胞凋亡和抗增殖作用的信號通路，用PYZ治療時14-3-3亞型(ζ和σ)同時丟失，促凋亡蛋白(Bad和Bax)表達增加，誘導凋亡。

疾病復發和遠處轉移的新標志物的發現可以幫助識別癌癥的發展階段。14-3-3蛋白靶標藥物的發現不僅會對涉及14-3-3蛋白的疾病產生治療性干預，還將擴展我們對其生物學功能的理解。

5 小 結

改進癌癥檢測和治療策略的關鍵是鑒定相關分子和信號轉導途徑，14-3-3蛋白家族與多種細胞途徑的數百種蛋白質相互作用并調節，不僅起到維持正常細胞穩態的作用，而且失調時，會促進癌癥的發生發展。14-3-3蛋白可以調節許多重要的蛋白質，很可能在許多正常的細胞功能中起重要作用。因此，14-3-3蛋白功能的全局抑制可能在正常細胞中具有未知的后果。理想的假設，靶向14-3-3蛋白的分子是同種特異性的，破壞它們的二聚化或與特定靶標的結合，或者不是靶向14-3-3蛋白，而是可以針對受14-3-3蛋白調節的靶標進行治療，對疾病的診斷和治療具有潛力，也將成為我們今后的研究方向。