屏障環境的哨兵動物應用

趙 勇, 范 春, 朱閩娟, 金 益, 陳國強

(上海實驗動物研究中心, 上海 201203)

實驗動物屏障環境(barrier environment)是指符合動物居住要求，嚴格控制人員、物品和空氣進出，適用于飼育清潔級(clean animal, CL)和/或無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級實驗動物的系統設施。實驗動物隔離環境(isolation environment)是指采用無菌隔離裝置以保持無菌狀態或無外源污染物。隔離裝置內的空氣飼料、水、墊科和設備應無菌，動物和飼料的動態傳遞須經特殊的傳遞系統，該系統既能保證環境的絕對隔離，又能滿足轉運動物時保持與內環境一致，適用于飼育SPF級、悉生級、無菌(germfree)級實驗動物[1,2]。本文所指屏障環境哨兵動物設置技術也可應用于隔離環境。

屏障系統空氣經初效、中效、高效過濾器進入屏障系統, 潔凈度達到7級, 一般壓差為20 Pa,沉降菌最大平均濃度(CFU/0.5 h·Φ90 mm平皿)≤3，要求工作人員身體健康，在淋浴后穿戴無菌工作服、口罩、帽子、手套或者穿戴無菌衣、口罩、帽子、手套，風淋后進入屏障環境。

實驗動物的哨兵動物一般是指用于監控實驗動物飼養環境中病原及病原感染的動物[3]。哨兵動物一般來源于與被監測動物遺傳學背景相同、微生物背景明確的動物。本技術所述哨兵動物借鑒食品衛生哨兵動物應用范圍，除了作為微生物檢測所設置的指示動物，同時監測實驗動物飲水、飼料的安全與營養水平，以及其有害物質的污染狀況和風險評估。

1 屏障環境哨兵動物設置總則

一是能夠全面反映整個屏障系統的環境狀況。二是設置的哨兵動物是同環境中在試實驗動物替難者，同時也要注重哨兵動物的福利，做到一鼠多檢、一鼠多用，既是微生物監測的指示動物同時也是飼料營養、飲水等的監測動物。三是根據每個屏障設施特點設置哨兵動物，遵循實驗動物3R原則的實踐[4-6]。

2 實驗動物哨兵動物設置

2.1 哨兵動物遺傳學分類的設置選擇

2.1.1 選擇與被監測動物一致的品系 每個品系的動物各自都具有獨特的生物學特性，近交系動物由于等位基因完全一致，動物對外界的反應所呈現的表現型也趨一致, 4周齡ICR小鼠, BALB/c小鼠，C57BL/6小鼠，分別飼喂同種含過期魚粉飼料，與飼喂正常飼料對照組小鼠產生體質量差異(P＜0.05)的時間分別是9周齡、7周齡和8周齡，并且差異隨周齡延長而加大，說明不同品系動物對藥物或毒物的耐受有差別。建議選擇與被監測動物敏感性一致的動物作為哨兵動物。由于大鼠、小鼠的品種差異，大鼠、小鼠病毒感染范圍不完全一致，那么同一設施內部大鼠、小鼠都必須分別設置哨兵動物。對于轉基因小鼠, 哨兵動物應盡量選擇其背景小鼠。

2.1.2 選擇近交系動物 雖然非近交品系繁殖性能強，且對飼料的營養缺乏有一定耐受性，動物便宜易得，但封閉群或遠交系也同時存在對病原體和對某種營養素缺乏，機體反應比近交系動物慢的缺點, 近交系動物相對非近交動物對疾病易感程度高, 臨床表現型也早。目前轉基因小鼠應用廣泛, 轉基因小鼠的背景品系小鼠多采用BALB/c和C57BL/6兩種近交系小鼠, 實驗表明，BALB/c小鼠比C57BL/6小鼠對飼料營養缺乏敏感性更高。

2.2 實驗動物哨兵動物微生物學分類的設置選擇

2.2.1 選擇SPF動物 理論上，選用的哨兵動物應為無菌動物或已知菌動物和SPF動物，并且要求預知動物體內抗體攜帶情況。但實際應用中大都采用SPF級動物。無菌動物或已知菌動物價格昂貴，病原體感染死亡率高，故多選用有針對性的SPF動物進行監測。例如小鼠肝炎病毒(MHV)的檢測是動物飼育室比較重要的檢測項目，運用BALB/c 和C57BL/10小鼠感染率和死亡率都很高，但C57BL/10 感染鼠痘病毒(mouse pox)后不出現明顯癥狀[7,8]。

2.2.2 免疫缺陷動物的選擇 免疫缺陷動物感染病原體后抗體生成率低，尤其是NOD-SCID小鼠、NSG小鼠等重癥免疫缺陷小鼠的血清學試驗常呈陰性，故可能造成假陰性反應。裸小鼠等一些免疫缺陷鼠對飼料的營養及軟硬度的要求均異于其它小鼠，除非有特殊需求，一般不選用裸小鼠作哨兵動物，但是考慮到對病原持續性感染有利于病原的分離，可選用有毛雜合體小鼠，例如BALB/c (+/nu)[5]。

2.3 實驗動物哨兵動物性別及周齡的設置選擇

2.3.1 哨兵動物性別的選擇 有文獻[4]認為，選擇哨兵動物以雌性動物為宜，既可減少動物打斗機率，又可避免意外交配形成的遺傳污染。但雄性BALB/c和C57BL/6的性成熟均晚于雌性動物，且不存有4～5 d的性同期，激素水平的波動也較雌性為小，雄性動物通過快速生長期到體質量平臺生長期時間要比雌性動物晚一周左右，所以實驗動物營養監測多采用雄性動物。而且目前飼育動物的IVC籠也不存在意外交配所形成的遺傳漂變。故可以在飼肓室設置二雌一雄或單一雄級哨兵鼠籠盒。

2.3.2 哨兵動物周齡選擇 文獻[5,6,9]建議選擇的適齡動物通常為3～8周齡，并能較好反映出被監測動物健康狀況。但是目前使用的BALB/c雌鼠3周齡時體質量只有14 g左右，且在轉基因動物繁育過程中離乳時間即為4周，建議選擇4周齡以上動物作為哨兵動物。再則，考慮到對飼料營養的監測時的快速生長周期為4～10周左右，所以哨兵動物的周齡選擇為4～6周為宜。

2.4 實驗動物哨兵動物數量設置

2.4.1 哨兵動物的檢測數量 實驗動物哨兵動物放置數量為飼育動物數的千分之一，如為公用動物實驗室則哨兵動物的數量要提高1倍, 檢測動物數量即為放置動物數量, 每籠3只動物。以一個實驗飼養單元(同飼養員, 同實驗人員)管理的SPF級特定飼養區50 m2，共4臺IVC籠位數為560籠，設置哨兵動物為5只。這相對于歐洲實驗動物學會聯盟 (FELASA)推薦的計算公式[6]。當期望檢出陽性率達30%時，所需的動物數至少為10只。建議哨兵動物放置和檢測數量應該根據檢測頻率變化而有所調整，當連續3個檢測頻次的陽性檢出率均為零時，也可適當減少哨兵動物數量。

2.4.2 哨兵動物的檢測頻率 無論是微生物監測和飼料營養監測，建議都是每月1次。檢測頻次增加相比檢測動物數量增加，更可能提高哨兵動物使用效率及檢測陽性率。由于病原的宿主特異性相差甚遠，有的飼養單元的動物品系各異，對病原的血清學反應也不同，所以每月1次的監測是必要的；同時考慮到大鼠、小鼠的快速生長期為3～8周左右，所以在1個月內動物對營養需求旺盛，故營養檢測的陽性率也可提高。當連續3個頻次的陽性檢出率均為零時，也可適當延長檢測周期，但是不應該少于FELASA 和我國通常使用的檢測頻率即每季度1次[9,10]。

2.5 哨兵動物設置的位置及接觸方式

2.5.1 哨兵動物放置位置 實驗動物飼育方式有開放平板架飼養，lVC飼養及隔離器飼養等。動物室的氣流出口一般設在飼養室四周角落，那么在開放架飼育環境中的底層靠近出風口處為最佳放置位置。各型號IVC設置氣流方式有所不同，但一般在T字型籠位處氣流較強，故哨兵動物應放置在底層中間位置或正中位置[11]。可以放置既接受舊墊料又接受廢氣的哨兵動物來增加檢出率[12]。在隔離器中飼育的哨兵動物，可設置于出風口下方并可采用50% 舊墊料法提高檢出率[13]。如果是對環境設施進行微生物監測，那么對環境氣流的進風口也必須設置哨兵動物[14,15]。

2.5.2 哨兵動物接觸方式 直接接觸即將哨兵動物直接放入到被監測動物籠中與被監測動物共同飼育2周以上，使哨兵動物直接接觸氣溶膠、塵埃粒子及排泄物[9]，此法雖然快捷靈敏，對接觸傳播病原及營養監測有高效性，但缺陷是監測樣本量少及動物間打斗和求偶行為等對其干擾影響輕大[12]。間接接觸即將被監測的動物籠盒中的廢墊料部分或者全部給予哨兵動物飼養籠。建議50%臟墊料來源于20籠左右被監測的動物，飼養時間 4周以上[13,14]，同時應用廢氣通入哨兵鼠籠(氨濃度控制在14 mg/m3以下)可以有效增加IVC系統中的微生物監測效率[14]。

無論是直接接觸還是間接觸均不能排除雄性動物求偶及其打斗行為發生，故建議設置單一雌性動物或前述2雌1雄的哨兵動物設置。

2.6 隔離檢疫場所及動物運輸過程監測設置

實驗動物進出口的檢疫工作除按照《中華人民共和國進出口動植物檢疫條例》的規定辦理外，也必須按照《實驗動物管理辦法》的規定處理，進口大鼠、小鼠要求有14d的檢疫隔離期，隔離期間并未要求有哨兵動物參與，但出于對動物飼養場所本身生物安全考慮，動物到達的72 h內應采血樣、皮毛和糞便樣品進行檢測并在動物群中放入接觸式哨兵動物，18 d后進行檢測[12]。由于目前進口實驗動物檢疫期只有14 d，故可在檢疫隔離期滿即對哨兵動物進行檢測。并對通過檢疫入場后動物飼育的IVC每層放置哨兵籠盒，用舊墊料法進行監測。

運輸是實驗動物進出口必不可少的環節, 為使運輸過程中的污染風險降低到最小, 應用哨兵動物對整個運輸過程進行監測是一個有效的方法[15]。陸路運輸選擇UPS供電的IVC或隔離器比較可靠，同時長途運輸對動物的應激較大，其中空氣對實驗動物質量影響最大現有的紙盒包裝不能完全避免污染，所以運輸期間安放哨兵動物以及在運輸工具和隔離場所均可以放置哨兵動物21 d以上時間，每月例檢也同樣重要。進口實驗動物和出口實驗動物均建議在其中加入哨兵動物共同運輸，運抵目的地后可進行剖檢。目前實施的14 d檢疫觀察期如不進行實體動物剖檢，存在較大污染風險。

綜上所述，屏障環境哨兵動物的設置是保證實驗動物質量的主要手段，除根據環境設施的特點選擇哨兵動物的種屬、品系、性別、周齡、數量、接觸方式、放置位置、檢測頻次外，還應考慮哨兵動物的抓取應激和運輸應激等人為因素對監測結果的干擾。

同時根據實驗動物3R 理念，除了哨兵動物應用于微生學監測外，充分利用哨兵動物對飼料營養進行監測。而不是檢測哨兵動物呈陰性即處死其余同籠哨兵動物[11]。提出設置哨兵動物數即為檢測動物數。