射血分數保留的心力衰竭動物模型的病理特征研究進展

董國菊, 劉劍剛, 官 杰

(1. 中國中醫科學院西苑醫院心血管病科, 中國中醫科學院心血管病研究所, 北京 100091;2. 青島市海慈醫療集團, 青島266033; 3. 天津中醫藥大學, 天津 300193)

心力衰竭(heart failure，HF)是多種心血管疾病的終末階段，且發病率高而且預后差，是慢性心血管疾病防治的重要內容。2016年歐洲心臟病學會(ESC)最新的HF指南將HF分為3種類型[1]: 射血分數減低HF(heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF，LVEF＜40%)、射血分數保留HF(heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF，EF≥50%)和射血分數中間值的HF(heart failure with midrange ejection fraction, HFmrEF, LVEF 40%～49%)。流行病學研究[2]發現，HFpEF發病率逐年上升，病死率與HFrEF相當，但患者的生活質量受損更加明顯。HF流行病學研究[3,4]結果顯示，我國心血管病患病人數處于持續上升階段，HFpEF占HF總數的半數以上，是目前老年人的主要HF類型。最為棘手的是，治療HFrEF的臨床方案并不適合HFpEF，目前為止尚無一種藥物治療證實可降低HFpEF的發病率和病死率，所以HFpEF已經成為心血管疾病防治領域的社會公共難題, 使HF的防治工作顯得愈發任重而道遠。

研發防治HFpEF的新藥，重點是改善患者的預后。目前，闡釋藥物的藥效藥理及藥代學特點，亟需建立能夠反映HFpEF的發病機制、病理特點的動物模型。HFpEF是一個與年齡、高血壓、糖尿病和血脂代謝異常等多種危險因素和臨床疾病相關的復雜臨床綜合征，如何構建與臨床發病特點相似的模型是目前研究的方向和重點。不同的造模方法不僅存在技術和設備要求、造模時間和經濟投入等差別，更重要的是會存在不同的心肌結構和功能的損傷，影響和評價治療的效果、策略及作用靶點。為了更好地了解和研究HFpEF，茲將近年來有關HFpEF的動物模型制作及病理生理特點進行綜述。

1 壓力負荷型HFpEF模型

壓力負荷型HFpEF模型是指HF的形成是由于心臟壓力超負荷所致。主要表現在使心臟后負荷增加，心肌收縮增加，心肌細胞增殖、肥大，逐漸纖維化，最終導致心肌細胞舒張功能減低。目前常見的壓力性HFpEF模型有以下幾種。

1.1 Dahl-鹽敏感大鼠

DiNicolantonio等[5]研究表明，攝入過量食鹽能引起高血壓及與其相關的并發癥，如舒張性HF，而控制高血壓可有效降低發生HF的危險。李欣春等[6]將Dahl鹽敏感性大鼠給予 8% NaCl 高鹽飼料喂養20周，觀察大鼠行為及體征，檢測大鼠血壓、血清氨基末端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide, NT-proBNP)含量, 彩色超聲多普勒檢測大鼠左室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)及電子顯微鏡觀察心肌組織以及腎臟組織的超微結構等，結果顯示，高鹽飼養的Dahl 鹽敏感性大鼠血壓持續上升，最高可達250 mmHg，血清NT-proBNP水平升高，但是LVEF一直在50%以上。提示此種模型可較好地模擬正常大鼠繼發高血壓病進而發展成HFpEF模型的過程。Dahl鹽敏感性高血壓大鼠是遺傳性高血壓大鼠的品系之一，通過增加心臟后負荷使左心室舒張功能減退而逐漸形成HFpEF模型，該模型無需進行手術和專門給藥，只需在其生長過程中給予鹽即可成為高血壓HF模型[7]。

1.2 主動脈縮窄法

通過縮窄主動脈，使主動脈壓力升高而增加心臟后負荷，從而引起心肌逐漸肥厚、重構，最終心肌舒張功能逐漸減退而造成HFpEF。根據縮窄動脈的位置不同可以分為主動脈弓縮窄和腹主動脈縮窄。主動脈弓縮窄手術多采取頸部進入，需在全身麻醉支持下借助呼吸機輔助呼吸，進而縮窄主動脈弓。這種模型制作方法，動物死亡率較高，術者須有比較豐富的經驗和技術支撐。腹主動脈縮窄手術多實施腹部入路，雖然術后也容易出現感染死亡，但死亡率相對較低。主動脈弓縮窄法制作HFpEF模型一般至少要4周左右成模時間[8]，而腹主動脈縮窄法則需要更長的成模時間，至少6周左右心臟超聲才能表現出HFpEF相關特征[9]。這兩個模型也是通過增加心臟后壓力負荷導致心室肥厚，心臟舒張功能減退，在8周之內都是以HFpEF為主，隨著時間進展，有可能發展成為終末期的HFrEF。

1.3 自發性高血壓大鼠模型

自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)的高血壓發生率高, 5周齡時血壓開始升高, 并持續上升, 到10周齡時血壓可達180 mmHg,16周齡時高血壓的相關并發癥已經形成，收縮壓在160 mmHg以上。隨著血壓升高，SHR外周血管阻力持續增加，心肌細胞逐漸肥大，出現了與人類高血壓患者相似的并發癥即心、腦、腎的相關損害。SHR模型的發病機制、心血管并發癥及外周血管阻力變化等都與人類高血壓患者相似，是目前國際公認最接近于人類原發性高血壓的動物模型[10]。但是該模型動物價格較貴，飼養條件要求高，而且成模時間長，4月齡左右心臟超聲方能出現HFpEF的結構特點。

1.4 繼發性高血壓大鼠模型

通過造模使腎動脈狹窄引起繼發性高血壓，也可以引起與SHR類似的HFpEF模型。

1.4.1 單腎單夾腎血管性高血壓HFpEF模型 該模型是通過切除一側腎臟，對對側腎動脈進行縮窄術造成繼發性高血壓，從而逐漸發展為HFpEF模型。該模型一般多選取雄性大鼠，采用戊巴比妥鈉麻醉，文獻報道多用銀夾縮窄一側腎動脈直徑(也有用絲線結扎)。其血壓升高的機制主要是血管緊張素系統激活以及交感神經活性增高，然后引起心肌細胞肥大、增殖及心室重構, 從而造成HFpEF模型[11]。但是這類模型手術成功率低，死亡率高，限制了研究應用，目前已經較少使用。

1.4.2 兩腎一夾型腎血管性高血壓HFpEF模型該模型是通過銀夾狹窄一側腎動脈，造成該側腎臟缺血，而另一側腎臟不觸及，也多選擇雄性大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。其血壓升高的機制主要是由于腎臟缺血而造成腎素增多，腎素-血管緊張素系統激活所致[12]。相比單腎單夾腎血管性高血壓HFpEF模型，該模型造模更簡單，成功率更高，且與人類高血壓病理過程具有相似性，是目前常用的經典高血壓動物模型，也是目前研發HFpEF藥物選用較多的一種模型。

1.4.3 雙腎雙夾型腎血管高血壓HFpEF模型 該模型用銀夾狹窄雙側腎動脈，造成雙側腎臟缺血。通常選用雄性大鼠，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，自制環形銀夾分別鉗夾雙側腎動脈起始部，術后腹腔注射少量青霉素預防感染。該模型會持續激活腎素-血管緊張素系統，一方面直接收縮血管，另一方面增加交感神經遞質的釋放及醛固酮和內皮素等活性物質的釋放，以腦血管硬化和心臟肥厚為主要特點，腎無嚴重結構和功能損害。與單腎單夾、雙腎單夾法的高血壓大鼠相比，雙腎雙夾腎血管性高血壓大鼠血壓峰值高且穩定，術后2周血壓急驟上升，血壓走勢與SHR趨于一致，隨觀察時間延長，血壓水平繼續穩步升高，與人類高血壓病的血壓演變過程基本一致。與SHR相比，雙腎雙夾腎血管大鼠具有價格便宜、飼養容易、模型復制方法簡單等優點。該模型是我國首創的高血壓大鼠模型，目前正在國內推廣使用，并逐漸被國外專家認可[13]。

1.5 肺動脈高壓型HFpEF模型

Meng 等[14]認為HFpEF不僅與左室舒張功能不全有關，也常常繼發于臨床代謝綜合征，肺動脈高壓同樣是引起HFpEF的常見臨床病因。迄今為止，人們之所以缺乏有效方法治療HFpEF，主要歸咎于缺乏有效的動物模型。通過對36個品系小鼠進行高脂飼料的造模篩選, 最終發現AKR/J，NON/shiLtJ和 WSB/EiJ小鼠在高脂飼料喂養下更容易發展為肺動脈高血壓導致的HFpEF，尤其AKR/J小鼠, 造模可重復性好, 通過連續20周的高脂飼料喂養，AKR/J小鼠會出現肺動脈壓升高，右室收縮壓升高，左室舒張末壓升高，進而出現左室和右室肥厚, 同時合并糖耐量異常, 是一種理想的、安全有效的肺動脈高壓型HFpEF模型。

Wallner 等[15]等建立了一種貓科動物肺動脈高壓導致的HFpEF模型。選擇家養雄性短毛貓，采用傳統方法結扎縮窄主動脈，通過4個月緩慢持續的壓力負荷，模型逐漸出現左房擴大，向心性左室肥厚，并最終出現肺動脈高壓和左室主張功能減退的HFpEF模型。

2 缺血型HFpEF模型

慢性心肌缺血是由于高血壓、高血脂、高血糖、吸煙等因素造成冠狀動脈狹窄或者堵塞，進而逐漸導致心肌缺血，缺血性HFpEF模型更適合研究冠心病慢性心肌缺血引起的缺血性心肌病的病理生理過程。造模方法主要有冠狀動脈外慢性收縮法、冠狀動脈內慢性狹窄法以及藥物法。

2.1 冠狀動脈外慢性收縮

又稱Ameroid縮窄環模型，是目前應用比較廣泛的慢性心肌缺血模型，通常使用大型動物如豬、犬等，此模型的縮窄環由酪蛋白吸濕物制成，外包鋼制套環，通常置于冠狀動脈左回旋支，吸濕物會吸收組織液并向內膨脹，在壓迫動脈2～4周后會完全堵塞冠狀動脈。這類模型通常需要選擇中、大型動物，經濟造價高，且造模死亡率較高，缺血面積大的往往發展為射血分數減低的心衰模型，并且缺血面積與選擇的實驗動物有關[16]。

2.2 冠狀動脈內慢性狹窄

冠狀動脈內慢性狹窄是通過微創介入方法，經冠狀動脈左前降支植入栓塞物或可機械性損傷血管內膜的球囊，隨植入時間延長可栓塞冠狀動脈或因損傷導致血管平滑肌細胞遷移致血管狹窄，引起心肌慢性缺血性改變，從而導致心肌損傷[17]。一種方法是經導管在冠狀動脈前降支內注入微栓塞球栓塞冠狀動脈[18], 并不造成明顯的心肌梗死，而是以慢性缺血為主, 從而形成HFpEF模型。后又有學者[19]對這種方法進行了改良，夾閉主動脈后經左心室內注射月桂酸鈉達冠狀動脈，造成冠狀動脈微栓塞心肌缺血模型。與傳統微球栓塞相比，所形成的微血栓中不但有血小板的聚集及纖維蛋白水平的升高，而且還伴有內皮損傷及較嚴重的炎癥細胞浸潤; 二者所形成的微梗死灶皆為鍥形呈局灶性分布，但月桂酸鈉組梗死部位炎癥反應較重，在病理發病機制上比較貼近于臨床。月桂酸鈉構建的大鼠冠狀動脈微栓塞模型，最佳劑量和時間點分別為 200 μg和3 h。冠狀動脈內栓塞造模的這種操作往往需要在豬等大動物身上進行，操作復雜，條件要求高且費用昂貴。

2.3 異丙腎上腺素法

異丙腎上腺素是β受體興奮劑, 可以使心率加快，心臟收縮增強，心肌耗氧及心臟負荷增加，導致心肌相對缺血缺氧而出現心臟功能衰竭[20]。徐為民等[21]用10 mg/kg鹽酸異丙腎上腺素每日腹部皮下注射，至3周時，小鼠由于心率加快，心肌強烈收縮，出現心肌缺血而導致的心肌細胞壞死及纖維化，繼而出現心臟功能衰竭。該模型可操作性強，小動物也可以進行造模，需要的造模周期也較短，一般3～4周即可。但是該種動物模型穩定性差，與異丙腎上腺素的劑量有關，其壞死面積為小灶性壞死或者融合壞死，不能精確定位梗死區域，和臨床的心肌梗死有一定差異。

3 復合型HFpEF模型

高血壓、血脂代謝異常、糖尿病、冠心病、左室舒張功能不全、心律失常等都與HFpEF的發生發展密切相關，故臨床上HFpEF往往與多種臨床并發癥共存，故復合了糖尿病、血脂異常、高血壓等多種病理機制的復合模型更能模擬臨床HFpEF的發病過程。

3.1 高血壓合并高脂血癥

高脂飼料通常是在基礎飼料上添加豬油、膽固醇、膽酸鈉等，長時間喂食后會使動物血脂升高，血管狹窄，血液流動減慢，此種方法比較接近人類因缺少運動、嗜食肥甘厚味等罹患的慢性心肌缺血。但是單純高脂飼料喂養不足以造成HFpEF模型，故常聯合其他因素造成復合模型。高血壓合并高脂血癥模型即是以高脂飼料喂養SHR，構建高血壓合并高脂血癥大鼠HFpEF模型，為高血壓合并高脂血癥引起的HFpEF提供藥理和藥效及發病機理的相關研究。對SHR大鼠連續高脂飼料喂養23周后，血脂水平紊亂明顯，心肌細胞肥厚明顯，腎組織小葉間動脈血管壁顯著性重構，提示SHR合并高脂飲食更能模擬人類高血壓合并高脂血癥的臨床表現，有望廣泛用于HFpEF的相關研究。但是與單純的SHR相比，該模型更符合臨床發病特點，但是和SHR一樣，造模費用高，歷時長[22]。

3.2 高脂血癥聯合異丙腎上腺素

聯合高脂飼料喂養和異丙腎上腺素皮下注射的方法制造HFpEF模型。先每日給予大鼠高脂飼料(3.5%膽固醇、10%豬油，0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、5%白糖、80.8%基礎飼料)喂養，8周后皮下注射異丙腎上腺素4 mg/kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續 3 次，每間隔24 h，誘發冠狀動脈痙攣心肌缺血[23]。這種復合模型成本低，造模時間比單一因素時間短，與臨床發病更有相似性。

3.3 高血壓合并糖尿病

Bonow等[24]發現左室HFpEF中53%～60%為高血壓性心臟病， 20%～26%為冠心病，10%為肥厚性心肌病。 以上數據證明高血壓是引起左室DHF 的常見病因之一。 糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病的重要慢性并發癥之一，其核心病理改變是心肌間質纖維化，主要表現為心肌細胞外基質堆積、心肌肥厚及心肌重構[25]。DCM心臟順應性降低，心臟收縮及舒張功能障礙，是糖尿病心臟病變導致HF的重要原因。

高血壓合并糖尿病模型即是結合2種危險因素制造的HFpEF模型，更能貼近臨床發病特點。一般是在高血壓模型基礎上復合腹腔注射丁胺卡那霉素及鏈脲佐菌素作為造模要素。或先用二腎一夾的方法制作高血壓大鼠模型，再以尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ，40 mg/kg)，制成高血壓糖尿病模型[26]。這種復合模型較單一的高血壓模型和糖尿病模型更能反映HFpEF的發病特點。

3.4 高血脂合并糖尿病

高糖高脂膳食基礎上聯合STZ誘導法。大鼠喂高糖高脂飼料 6 周后，按 30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ，72 h后尾靜脈取血測空腹血糖，大于 7.77 mmol/L者為造模成功，繼續喂養高糖高脂飼料 6 周，即可出現HFpEF的病理特點[27]。

3.5 高血壓合并抑郁

采用SHR模型, 同時結合力竭游泳(每周6次,每次游泳至耐力極限，即大鼠四肢劃動無力，身體豎立，整個頭部浸入水中，10 s不能自行浮出水面為力竭，立即將大鼠撈出)、高脂飲食飼養等方法誘導建立高血壓HFpEF大鼠模型，連續造模12周，觀察其表現及相關生化指標，探討HFpEF抑郁的生物學基礎。

4 結語

HFpEF和HFrEF 雖然有著相似的臨床表現，但其病理生理過程和治療方法卻不盡相同[28]，目前治療HFrEF的指南不適用于HFpEF的治療，HFrEF患者生存率已經得到明顯改善, 而HFpEF的治療卻不盡如人意[29]。原因之一就是目前尚沒有公認的能代表HFpEF臨床發病特點的模型出現。

通過對目前能在一定程度上反映HFpEF病理特點的模型進行綜述，可以看到不同模型有不同的發病特點，不同模型有不同的造模周期，不同模型有不同的技術含量。雖然不同模型為研究不同側重點提供了更好的針對性，但是普適性的HFpEF模型更具有代表性。而復合模型將會是普適性HFpEF模型的主要發展方向, 通過聯合2～3種甚至是更多種因素共同導致的HFpEF模型將更加符合臨床HFpEF的發病特點，比如高血壓、高血脂合并高血糖，如果模型造模時間超過12周，基本也符合了高齡這一特點。除了模型的病因模擬，造模成功的關鍵評價指標也需要規范，不僅EF要大于50%，同時要伴有左心室結構的改變，比如左心室的肥厚、左心室舒張功能減退，同時伴有左心房的擴大和/或左房壓力的升高，需要特別注意的是左心室的舒張末內徑一般在正常范圍內。總之，適合的HFpEF動物模型需要不斷的摸索和探索，方能更加貼近臨床，為研發新藥做好堅實的基礎。