骨髓間充質干細胞來源外泌體在疾病中的應用研究進展

骨髓間充質干細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）是來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞[1]，在特定條件下，可分化為不同類型的細胞[2]，如骨、軟骨、心肌細胞、上皮細胞和肝細胞等。BMSCs 主要存在于全身結締組織中，骨髓中含量最豐富，來源充足，容易獲得，能在體外培養擴增，廣泛應用于多個醫學領域，如組織工程、基因治療和器官移植[3，4]。但隨著進一步研究發現，BMSCs 在疾病中發揮作用可能并不是因為其自我增殖分化的特點，而是通過旁分泌機制來實現的[5]，其中外泌體是間充質干細胞旁分泌的重要組成部分[6]。

外泌體（Exosome，Exo）是在上個世紀被發現的，觀察到網織紅細胞能夠分泌一種小囊泡，能介導受體的清除，然而在當時研究者只將其看作是細胞不需要的成分并未關注[7]。直到Zitvogel 等[8]研究證實了Exo 可能是介導細胞間信息交流的重要物質，與其相關研究不斷增加。已有研究發現可以從機體體液中分離出Exo，如尿液、唾液、血清、母乳、羊水、惡性胸腔積液等，幾乎包括所有的體液[9]。有文獻表明間充質干細胞相比其他細胞能夠產生足夠數量的外泌體，其干細胞的增殖分化特性是通過Exo 進行調控的[10]，目前研究較多的是BMSCs。現對骨髓間充質干細胞來源外泌體（BMSCs-Exo）在各個系統疾病中的最新應用進展作一綜述。

1 外泌體生物學特性

1.1 外泌體概念外泌體是特殊的膜外囊泡，其直徑為40～100nm，密度為1.13～1.19g/ml，具有穩定的雙分子磷脂結構，能保護其自身攜帶的DNA 片段、miRNA、mRNA 以及功能性蛋白等生物活性物質不被破壞[11]，能通過組織液或血液運輸至靶細胞，在細胞間信息傳遞過程中發揮重要作用，因此可認為是細胞間的通訊信使[12]。

1.2 外泌體的形成與生物學功能

1.2.1 外泌體形成過程 外泌體的形成是按照特定方向進行的，最初部分細胞膜向內凹陷形成早期核內體，接著再次凹陷并選擇性地包裹胞漿內的蛋白質、脂質及核酸物質而形成晚期核內體或稱多泡小體，然后這些多泡小體會轉運至細胞膜或經溶酶體途徑降解，多泡小體與細胞膜融合，最后釋放出里面的小囊泡，即為外泌體[13]。

釋放至細胞外的外泌體通過內分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞。外泌體與靶細胞有3 種作用方式：①外泌體可直接與細胞膜融合；②外泌體通過細胞膜表面的受體識別進入細胞內；③外泌體能被靶細胞內吞進入胞內[14]。與靶細胞作用后，外泌體還可通過釋放自身的活性物質將信息傳遞給靶細胞，從而介導細胞間的信息交流，調控靶細胞的生理過程。

1.2.2 外泌體生物學功能 外泌體行使的生物學功能和其本身所含的蛋白質、mRNA、miRNA 及周圍的微環境有關，作用于靶細胞后釋放內容物激活胞內相關信號通路，進而調控細胞的功能和生物學行為[15，16]，如細胞凋亡、血管生成、再生修復、炎癥反應和免疫應答等[17]。此外，外泌體可作為miRNA的運載體，在細胞間傳遞miRNA，miRNA 可降解靶細胞內mRNA 而引發mRNA 沉默，調控目的蛋白的表達[18]。基于外泌體可運載活性物質這一特性，最新研究還發現外泌體可以作為藥物載體，將藥物包裹并且靶向傳遞至靶細胞，用來替代某些易水解的藥物，提高療效[19]。外泌體的這些生物學功能在很大程度上有助于各種疾病的治療。

2 骨髓間充質干細胞來源外泌體在疾病診治中的應用

2.1 在呼吸系統疾病中的應用急性肺損傷（ALI）是常見的肺部疾病，可導致肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，肺泡及肺間質彌漫性水腫，嚴重時還會導致急性呼吸窘迫綜合征[20，21]，造成較大的社會經濟負擔，已有研究證實BMSCs 治療急性肺損傷的動物模型具有一定療效[22]。ALI 是引起多器官功能障礙的主要原因，Liu 等[23]通過阻斷大鼠腸系膜上動脈建立腸缺血再灌注（IIR）模型，發現靜脈注射BMSCs-Exo 后能通過減少肺細胞凋亡和下調TLR4 受體的表達以及抑制NF-κB 通路的激活來減弱IIR 引起的肺損傷，說明BMSCs-Exo 可能通過抑制TLR4/NF-κB 信號通路調控炎癥損傷從而發揮肺保護作用，提示了IIR 介導的ALI 的外泌體治療方法是一種新的潛在策略。Phinney 等[24]發現BMSCs 不僅能通過細胞外囊泡（EVs）運輸線粒體調控巨噬細胞活性和肺組織功能，而且攜帶miR-451 的EVs 可使巨噬細胞對攝入的線粒體失去敏感性，減輕實驗性矽塵誘導肺纖維化的損傷。說明外泌體自身所含的miRNA 也參與BMSCs-Exo在疾病中的應用。Zhang 等[25]證實在缺氧環境中BMSCs-Exo 能被鄰近癌細胞吸收，促進癌細胞侵襲，這與外泌體自身的miRNA 相關，Exo介導miR-193a-3p、miR-210-3p 和miR-5100 轉移可通過激活STAT3 信號通路促進肺癌細胞侵襲，這些外泌體攜帶的miRNA 有望成為無創腫瘤進展的生物標志物。

2.2 在循環系統疾病中的應用缺血性心肌梗死會導致心肌細胞壞死和瘢痕形成，進而影響心臟的功能。雖然目前有方法能在一定程度上改善心肌梗死后的心臟功能，但卻不能替換已壞死的心肌細胞[26]。Teng 等[27]研究發現BMSCs-Exo 顯著誘導臍靜脈內皮細胞的增殖遷移，可損傷T 細胞功能，縮小梗死面積，保持心臟收縮和舒張功能，顯著提高新功能毛細血管的密度，促進血流恢復，說明BMSCs-Exo能促進血管再生，抑制炎癥反應，從而改善缺血性損傷后的心臟功能。Bian 等[28]也發現BMSCs-Exo能夠改善心肌損傷，在低氧的刺激下BMSCs 能分泌大量的EVs，并且在大鼠心肌內注射EVs 能顯著提高血流恢復的速度，減小梗死面積以及維持心臟的收縮和舒張功能。心肌缺血再灌注損傷（I/R）是指心肌組織發生缺血后，通過治療恢復血液供應引起心肌細胞凋亡、壞死甚至導致心跳驟停的發生[29]。Chen 等[30]用結扎左前降支冠狀動脈的方法建立大鼠I/R 模型探討BMSCs-Exo 攜帶的miR-125b 對I/R 大鼠的影響，結果發現miR-125b 在I/R 心肌組織和細胞中表達下調，而注射攜帶miR-125b 的BMSCs-Exo 可顯著提高細胞存活率，降低凋亡率，減輕I/R 大鼠心肌組織的病理損傷，表明BMSCs 衍生的攜帶miR-125b 的外泌體可保護心肌I/R。

2.3 在消化系統疾病中的應用肝臟作為各種物質代謝、能量轉換的樞紐器官，其損傷修復是重點研究的內容。研究表明，MSCs-EVs 可以減少小鼠肝細胞損傷，促進肝細胞增殖，從而發揮保護作用[31]。而BMSCs-Exo 同樣在消化系統疾病中發揮重要作用。急性肝衰竭（Acute liver failure，ALF）是由多種因素引起的肝細胞壞死或肝功能障礙的臨床綜合征[32]。Zhao 等[33]通過建立D-半乳糖胺和脂多糖誘導的肝細胞損傷和凋亡模型，發現經BMSCs-Exo處理后，促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 的裂解表達水平都明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達水平上調，表明BMSCs-Exo 具有降低急性肝衰竭后肝細胞凋亡的作用，尤其是發現BMSCs-Exo 通過促進自噬來減少肝細胞凋亡。Pan 等[34]在進行體外實驗時指出骨髓間充質干細胞條件培養液可促進肝細胞的分化，能明顯阻止由H2O2介導的肝細胞凋亡。王如嶺等[35]發現小鼠移植BMSCs 來源的外泌體后，肝纖維化得到了一定程度的改善，說明BMSCs-Exo 對小鼠肝纖維化具有一定的治療和預防作用，但具體作用機制有待進一步研究。潰瘍性結腸炎臨床癥狀多樣，多反復發作，給多數患者的生活帶來了很大困擾。Yang 等[36]發現在結腸炎模型中注 射BMSCs-EVs 后發現NF-κBp65、TNF-α 和IL-1β 等促炎細胞因子水平下降，觀察到疾病活動度指數和組織學結腸損傷有所降低，指出BMSCs-EVs 可在一定程度上逆轉實驗性結腸炎。

2.4 在運動系統疾病中的應用近年研究發現BMSCs-Exo 在促進成骨分化、骨與軟骨再生過程中起著重要作用，也可有效改善骨質疏松癥狀。Qin 等[37]為探討BMSCs-EVs 在調節成骨細胞活性和骨再生中的作用，通過體內和體外實驗發現EVs 在體外對成骨基因和成骨細胞分化有正向調節作用，但對成骨細胞增殖無抑制作用；此外，還發現BMSCs-EVs 在臨界大小的顱骨骨缺損處導致更多的新骨形成。Zhang 等[38]通過股骨骨折大鼠模型實驗，發現移植注射BMSCs-Exo 可促進骨生成和血管生成，從而促進骨折愈合，這種促進作用可能歸因于激活BMP-2/Smad1/RUNX2 和HIF-1α/VEGF 信號通路。同樣，Furuta 等[39]通過建立CD9-/-小鼠股骨骨折愈合模型，發現小鼠的骨折愈合緩慢，通過注射BMSCs-Exo 能夠促進軟骨內成骨，加速在條件培養基中骨折愈合，而注射缺乏外泌體的條件培養基則未出現這種情況，說明外泌體可作為促進組織修復的一種新信號因子。骨質疏松癥（osteoporosis，OP） 是最常見的骨骼疾病，易發生骨折，嚴重威脅中老年人的健康[40]。葉慶元等[41]發現外泌體攜帶的miRNA 與維持機體骨量代謝平衡的相關激素密切相關。小鼠體內注射BMSCs-Exo，發現外泌體可通過轉運 miR-26，恢復雌激素缺乏導致的骨質疏松模型小鼠的成骨分化功能并緩解骨質疏松，有望成為未來治療骨質疏松的重要方法。

2.5 在神經系統疾病中的應用腦損傷與腦卒中是神經系統常見的疾病，其中腦卒中具有高發病率、高致殘率和高死亡率等特點，是危害社會健康的嚴重疾病[42]，但目前的治療手段效果不明顯。Zhang 等[43]為探討人骨髓間充質干細胞來源外泌體（hBMSCs-Exo）改善實驗性腦損傷（TBI）后的功能，通過Wistar 大鼠經皮質控制撞擊建立TBI 模型，尾靜脈注射hBMSCs-Exo，發現hBMSCs-Exo 通過促進內源性血管生成和神經生成，減少神經炎癥，在一定程度上顯著改善了TBI 后大鼠的功能恢復。Xiong 等[44]采用血管內穿孔法建立蛛網膜下腔出血（SAH）模型，發現股靜脈注射Exo 能改善SAH 后的神經功能，降低腦含水量，維持血腦屏障的完整性；同時也發現BMSCs-Exo 可通過釋放miRNA129-5p抑制HMGB1-TLR4 通路的活性，發揮抗炎、抗凋亡作用，減輕SAH 后的早期腦損傷。Zhao 等[45]指出過表達microRNA-25 的BMSCs-Exo 可降低脊髓缺血模型大鼠的IL-1β 和TNF-α 水平，增加脊髓中的超氧化物歧化酶活性，保護存活的神經元，證實外泌體可通過microRNA-25 增強BMSCs 對缺血性脊髓治療的神經保護作用。

2.6 在其他系統疾病中的應用來自骨髓間充質干細胞的外泌體已經應用于呼吸系統、循環系統、消化系統、運動系統和神經系統疾病中。隨著近幾年對間充質干細胞的大量研究，BMSCs-Exo 在其他疾病中也有廣泛應用。在泌尿系統疾病中，Wang等[46]研究發現通過BMSCs-Exo 干預可使大鼠缺血再灌注腎臟損傷模型血清肌酐、BUN 水平降低，改善腎臟病理損傷，減少凋亡細胞數量，使炎性因子及Caspase-3 表達降低。在生殖系統疾病中，周政等[47]發現經BMSCs-Exo 治療后，大鼠血清中E2上升、FSH 水平下降，接近正常水平，各級卵泡數目均明顯增加，與模型組比較差異顯著；說明BMSCs-Exo 可通過調節血清中各激素含量，促進卵泡發育，修復卵巢功能。在乳腺疾病中，王丹丹等[48]發現小鼠乳腺癌細胞通過注射BMSCs-Exo 能夠增加其增殖、遷移及侵襲能力，其機制可能與上調 PI3K/Akt信號通路有關。目前BMSCs-Exo 應用于多個系統疾病的研究，為今后臨床藥物的研究與應用提供了新的思路。

3 小結

外泌體具有穩定的雙分子磷脂結構，能保護其自身攜帶的DNA 片段、miRNA、mRNA 及功能性蛋白等活性物質，通過內分泌或旁分泌的方式作用于靶細胞，與靶細胞作用后，外泌體通過釋放內容物將信息傳遞給靶細胞，在細胞間的信息傳遞過程中起著重要作用，調控細胞生物學行為。外泌體攜帶的miRNA，可在細胞間傳遞，能夠促進BMSCs-Exo在某些疾病中的作用。雖然目前BMSCs-Exo 在動物模型中可應用于多個系統疾病，減輕炎癥反應及細胞損傷，也可作為藥物載體，具有一定的應用前景，為疾病的治療和預防提供了堅實的基礎，但也存在許多難題，如如何高效大量地提取外泌體、如何保存以確保其活性、如何確定最適使用濃度以及如何將藥物包埋入外泌體而不被分解等。目前對BMSCs-Exo 的研究還處于初期階段，其作用于靶細胞的具體機制仍不明確，有待于進一步研究。