MicroRNA-136-5p靶向STAT3調(diào)控對(duì)脊髓損傷大鼠炎癥因子的影響*

吳楠，王濤，馬劍雄，呂工一，馬信龍

（1.天津醫(yī)院 脊柱外科，天津 300211；2.天津市中西醫(yī)結(jié)合骨科研究所，天津 300050；3.天津醫(yī)院 骨外科，天津 300211）

脊髓損傷是臨床上一種較為常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，對(duì)患者的中樞神經(jīng)產(chǎn)生損害，導(dǎo)致患者發(fā)生不同程度的肢體癱瘓或者喪失勞動(dòng)能力。近年來(lái)脊髓損傷的發(fā)生率逐年提高[1]。脊髓損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性損傷，其中原發(fā)性損傷為不可逆的損傷，繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷發(fā)生后逐漸形成的損傷，伴隨著自由基損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等基因表達(dá)和細(xì)胞代謝的改變，繼發(fā)性損傷對(duì)人體產(chǎn)生的危害甚至?xí)笥谠l(fā)性損傷[2]。有研究表明[3]，脊髓損傷發(fā)生后體內(nèi)基因的改變參與病理變化過(guò)程。microRNA（miRNA）屬于生物體內(nèi)較短的非編碼單鏈小分子RNA，生物信息預(yù)測(cè)miRNA可至少對(duì)人類30%的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，miRNA的發(fā)現(xiàn)為臨床上多種疾病的治療及機(jī)制研究提供了新的方向。研究顯示[4]miRNA可通過(guò)調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）通路，參與多種疾病的調(diào)控，其中STAT3屬于JAK-STAT信號(hào)通路中的核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其被激活變?yōu)榱姿峄疭TAT3（p-STAT3）后，一方面參與細(xì)胞的增殖、凋亡過(guò)程，另一方面可對(duì)免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)，在脊髓損傷疾病的發(fā)生、發(fā)展中有較重要的作用。目前對(duì)miR-136-5p靶向STAT3調(diào)控對(duì)脊髓損傷大鼠炎癥因子的影響研究較少，本文就該課題進(jìn)行研究，為臨床上脊髓損傷的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取60只SD健康大鼠，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，月齡3～6個(gè)月，平均（4.2±0.5）個(gè)月，體重 200～250 g，平均（224.6±6.5）g。所有大鼠養(yǎng)殖于干凈籠子里，室溫（22.1±1.8）℃，相對(duì)濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時(shí)間為1周。本實(shí)驗(yàn)獲得天津醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

miRNA-136-5p載體購(gòu)自北京合生基因科技有限公司，大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，小鼠抗大鼠白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素-21（IL-21）、白細(xì)胞介素-23（IL-23）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）抗體購(gòu)自北京義翹神州科技有限公司，兔抗小鼠STAT3、p-STAT3抗體購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司，兔抗大鼠腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗體、HE 染色劑、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 慢病毒載體構(gòu)建 miR-136-5p 表達(dá)抑制的慢病毒載體構(gòu)建及大鼠miR-136-5p的序列查找和設(shè)計(jì)由廣州易錦公司完成。重組的LV-miR-136-5p和LV-sponge（抑制載體）慢病毒表達(dá)載體由廣州易錦公司合成，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。行慢病毒滴度檢測(cè)，制備完成后重組慢病毒置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.3.2 分組及模型復(fù)制 將60 只大鼠按照完全隨機(jī)法分為對(duì)照組、脊髓損傷組、沉默組及過(guò)表達(dá)組，每組15只。脊髓損傷組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠復(fù)制脊髓損傷模型，對(duì)照組在模型復(fù)制期間不做任何處理。原發(fā)性脊髓損傷模型復(fù)制方法[5]：使用3%戊巴比妥鈉注射于大鼠腹腔做麻醉處理，劑量為30 mg/kg，暴露出大鼠T12～L1節(jié)段硬脊膜，在離大鼠脊髓10 cm高度處以自由落體方式使用5 g沖擊桿沿垂直沖擊通道對(duì)大鼠T13節(jié)段以下脊髓進(jìn)行打擊，大鼠立刻出現(xiàn)尾巴、軀干痙攣性擺動(dòng)及雙下肢回縮樣撲動(dòng)，且大鼠蘇醒后出現(xiàn)弛緩性癱瘓、排尿功能障礙。模型復(fù)制成功后，將10 μl miR-136-5p慢病毒懸液(病毒滴度為108TU/ml）在無(wú)菌環(huán)境下注射于沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠脊髓損傷區(qū)。對(duì)照組、脊髓損傷組大鼠注射等量的生理鹽水。

1.3.3 運(yùn)動(dòng)功能、脊髓神經(jīng)功能評(píng)價(jià) 使用 Beattie、Bresnahan、Basso（BBB）評(píng)分對(duì)4組大鼠運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)定前排空大鼠膀胱，上午10：00由3位實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)雙盲法進(jìn)行，取平均值。評(píng)價(jià)內(nèi)容包括關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)、行走、軀干穩(wěn)定性，滿分21分，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明大鼠運(yùn)動(dòng)功能越正常，21分表示大鼠運(yùn)動(dòng)功能正常。使用聯(lián)合行為評(píng)分法（combined behavioral score,CBS）對(duì)4組大鼠脊髓神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容包括大鼠運(yùn)動(dòng)功能分級(jí)、腳趾觸地反應(yīng)能力分級(jí)、端正體位反射、回縮反應(yīng)能力分級(jí)、伸展能力分級(jí)、游泳實(shí)驗(yàn)、斜板實(shí)驗(yàn)等，滿分為100分，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明大鼠脊髓神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重，100分表示大鼠后肢功能完全喪失，0分表示大鼠脊髓神經(jīng)功能正常。

1.3.4 組織切片及染色 4 組大鼠全身麻醉處理后，采用斷頭法處死，在無(wú)菌、低溫條件下取大鼠損傷節(jié)段脊髓組織，對(duì)照組大鼠取與其他3組大鼠相對(duì)應(yīng)節(jié)段的脊髓組織，大鼠腎組織在4%多聚甲醛中浸泡、固定，4℃環(huán)境下保存，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，5 min/次，然后在梯度酒精下脫水處理3 min，自來(lái)水沖洗1次；使用蘇木精染色5 min，自來(lái)水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中返藍(lán)處理2 min，自來(lái)水沖洗1次；0.5%濃度伊紅染色10 min，自來(lái)水沖洗1次；使用乙醇梯度脫水處理，常溫下使用15% EDTA脫鈣，脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制作3 μm厚的組織切片，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠脊髓的病理改變。

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè) IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平 大鼠模型復(fù)制前和復(fù)制2 h后取股靜脈血2 ml，保存。將采集到的標(biāo)本用50 mmol碳酸鹽包被緩沖液進(jìn)行抗原溶解，濃度為10～20 μg/ml，按100 μl/孔加入96孔酶標(biāo)板中，4℃過(guò)夜保存。第2天舍棄包被液，磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗滌3次，每孔中加入1%的BSA 150 μl，在37℃環(huán)境中封閉1 h。PBST洗滌3次，每孔中加入100 μl不同倍比稀釋度的血清，加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h。采用PBST洗滌5次，加入100 μl稀釋后的HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，顯色劑顯色20 min后，在酶標(biāo)儀上讀取A405吸收值。

1.3.6 Western blotting檢測(cè)脊髓組織 STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量 將采集到的標(biāo)本用PBS清洗3遍以上，分離PBS，加入IP細(xì)胞裂解液，裂解35 min，提取總蛋白，蛋白質(zhì)定量（BCA法）檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，通過(guò)10%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液15 min；100 V，電泳10 min，結(jié)束之后，將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，37℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST稀釋，按1∶1 000稀釋一抗Tubuli（n內(nèi)參照），4℃孵育過(guò)夜保存；第2天用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其浸在底物溶液中顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.7 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)檢測(cè) IL-17 mRNA表達(dá)水平 在無(wú)菌環(huán)境下取大鼠脊髓組織，使用Trizol法提取組織RNA，總反應(yīng)體系20 μl，42℃水浴60 min，70℃、5 min終止反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為反應(yīng)模板，總反應(yīng)體系為20 μl，IL-7正向引物序列：5'-GTGTC TCTGATGCTGTTG-3'；反向引物序列：5'-AACGGTTG AGGTAGTCTG-3'，產(chǎn)物大小為452 bp。退火溫度為57℃，95℃預(yù)變性 5 min，60℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸 10 min。取 6 μl PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并采集圖片，用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠運(yùn)動(dòng)功能、脊髓神經(jīng)功能評(píng)分比較

4組大鼠BBB評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠BBB評(píng)分低于對(duì)照組（P＜0.05），沉默組大鼠BBB評(píng)分高于脊髓損傷組、過(guò)表達(dá)組（P＜0.05）；4組大鼠CBS評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠CBS評(píng)分高于對(duì)照組（P＜0.05）；沉默組大鼠CBS評(píng)分低于脊髓損傷組、過(guò)表達(dá)組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 4組大鼠脊髓的病理組織學(xué)變化

對(duì)照組大鼠無(wú)脊髓損傷，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，膠質(zhì)細(xì)胞分布均勻；脊髓損傷組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠存在明顯的脊髓損傷，損傷部位結(jié)構(gòu)喪失，僅有少量的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目，存在細(xì)胞浸潤(rùn)；過(guò)表達(dá)組大鼠脊髓損傷較沉默組大鼠嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生。見(jiàn)圖1。

表1 4組大鼠運(yùn)動(dòng)功能、脊髓神經(jīng)功能評(píng)分比較（n =15，±s）

表1 4組大鼠運(yùn)動(dòng)功能、脊髓神經(jīng)功能評(píng)分比較（n =15，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 BBB評(píng)分 CBS評(píng)分對(duì)照組21.00±0.00 0.00±0.00脊髓損傷組2.67±0.25①② 89.65±3.56①②沉默組3.26±0.38① 65.32±1.67①過(guò)表達(dá)組2.01±0.12①② 95.68±4.62①②F值 13.827 6.006 P值 0.001 0.001

2.3 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平比較

4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脊髓損傷組、沉默組、過(guò)表達(dá)組大鼠脊髓組織中IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），沉默組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平低于脊髓損傷組、過(guò)表達(dá)組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA表達(dá)水平比較

4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），沉默組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組、脊髓損傷組及過(guò)表達(dá)組（P＜0.05）。見(jiàn)表3和圖2。

圖1 4組大鼠病理組織學(xué)切片圖（HE×200）

表2 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平比較 （n =15，pg/ml，±s）

表2 4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平比較 （n =15，pg/ml，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 IL-6 IL-21 IL-23對(duì)照組78.26±2.28 53.21±2.31 20.02±1.65脊髓損傷組87.56±1.25①② 72.13±3.00①② 30.49±1.01①②沉默組80.12±3.16① 63.23±1.68① 22.16±2.06①過(guò)表達(dá)組95.38±4.67①② 75.89±4.12①② 40.26±3.28①②F值 19.138 27.895 32.025 P值 0.001 0.001 0.001

圖2 4組大鼠脊髓組織中STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平

表3 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA 表達(dá)水平比較 （n =15，±s）

表3 4組大鼠脊髓組織STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA 表達(dá)水平比較 （n =15，±s）

注 ：?與沉默組比較，P ＜0.05。

組別 STAT3 p-STAT3 IL-17 mRNA對(duì)照組1.00±0.01? 1.00±0.05? 1.00±0.01?脊髓損傷組1.10±0.05? 1.21±0.07? 1.13±0.10?沉默組0.10±0.02 0.37±0.01 0.24±0.01過(guò)表達(dá)組1.23±0.16? 1.36±0.12? 1.35±0.12?F值 8.335 16.088 16.886 P值 0.001 0.001 0.001

3 討論

脊髓損傷發(fā)生后機(jī)體會(huì)出現(xiàn)原發(fā)性脊髓組織壞死、細(xì)胞溶解、繼發(fā)性損傷等，患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，損傷面以下的運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能、括約肌功能完全喪失或者不完全喪失[6]。患者神經(jīng)元會(huì)大量壞死、發(fā)生局部免疫炎癥反應(yīng)及缺血性水腫，目前臨床上常手術(shù)聯(lián)合藥物治療此病，以減輕繼發(fā)性損傷，但療效均不理想，患者預(yù)后較差。

近年來(lái)隨著對(duì)miRNA生物學(xué)功能機(jī)制的不斷深入研究，在多種動(dòng)植物、微生物中發(fā)現(xiàn)多達(dá)17 000個(gè)miRNA，和人類相關(guān)的miRNA包括1 000多種，為臨床多種疾病診斷、治療及預(yù)后提供新的方向[7-8]。有研究認(rèn)為[9-11]，當(dāng)機(jī)體處于正常生理?xiàng)l件下，miRNA能夠?qū)φＣ庖吖δ苓M(jìn)行調(diào)節(jié)，當(dāng)機(jī)體生理?xiàng)l件異常時(shí)，miRNA參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，miRNA表達(dá)出現(xiàn)異常，對(duì)紊亂的機(jī)體功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過(guò)一系列的作用，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。有研究表明[12]，miRNA可參與機(jī)體細(xì)胞增殖、凋亡、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程和疾病的發(fā)生過(guò)程。徐宏博等[13]認(rèn)為miRNA與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)類疾病相關(guān)，包括帕金森綜合征、阿爾茲海默病等。miRNA是一類長(zhǎng)19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)靶向靶基因3'-非編碼區(qū)，進(jìn)而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行抑制[14]。研究表明[15-16]，miRNA可通過(guò)靶向調(diào)控STAT3通路，對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。

STAT3屬于STAT家族成員，是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控基因的表達(dá)。STAT3位于染色體17q21區(qū)域，為DNA結(jié)合蛋白酶，能夠?qū)Ρ砥ぜ?xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激產(chǎn)生反應(yīng)。當(dāng)STAT3磷酸化后會(huì)導(dǎo)致STAT3二聚化、易位至細(xì)胞核中，與DNA結(jié)合，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)[17-18]。目前有研究報(bào)道[19]，Th17細(xì)胞分化與IL-6、IL-21、IL-23相關(guān)，可在絲氨酸激酶或者YAK的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)化為p-STAT3，之后形成二聚體并進(jìn)入至細(xì)胞核，和IL-17的啟動(dòng)子相結(jié)合，對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄，最終促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。有研究表明[20]，STAT3的過(guò)度表達(dá)與Th17細(xì)胞的分化相關(guān)。本研究中，對(duì)4組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平及STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，沉默組大鼠脊髓組織IL-6、IL-21、IL-23表達(dá)水平及STAT3、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量、IL-17 mRNA表達(dá)水平均低于過(guò)表達(dá)組大鼠，該結(jié)果提示miR-136-5p可通過(guò)靶向STAT3，抑制STAT3磷酸化，作用于Th17細(xì)胞，對(duì)Th17細(xì)胞炎癥因子水平進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)。

綜上所述，脊髓損傷后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥因子的過(guò)度表達(dá)，最終抑制脊髓炎癥反應(yīng)。

目前關(guān)于對(duì)miR-136-5p靶向調(diào)控STAT3的研究尚未有報(bào)道，本文研究了miR-136-5p靶向STAT3調(diào)控對(duì)脊髓損傷大鼠炎癥因子的影響，為臨床上脊髓損傷的研究提供了新的方向。