結直腸癌患者外周血和癌組織中Vδ1 T和Vδ2 T細胞研究

（衢州市人民醫院 腫瘤放療科，浙江 衢州 324000）

結直腸癌是西方國家癌癥相關死亡的第2大主要原因[1]。當前，用于晚期結直腸癌治療的主流藥物包括氟尿嘧啶、卡培他濱、奧沙利鉑等，可以單獨使用，也可兩種聯合使用[2]。由于其毒性和不良事件，這些治療藥物的應用均受到限制。進一步了解結直腸癌的發病機制，可為新藥研究和個體化治療提供支持。

γδ T細胞是不同于傳統αβ T細胞的一群T淋巴細胞，占人體外周血CD3 T細胞的1%～10%[3]，γδT細胞一直被視為機體固有免疫系統的重要成員之一[4]。γδT細胞可進一步分為2個細胞亞群：Vδ1 T細胞（主要分布于上皮性相關的淋巴組織）和Vδ2 T細胞（主要分布于外周血）[5]。Vδ2 T細胞主要參與機體對腫瘤的免疫監視和對病原體侵襲的防御反應[6-9]，是γδT細胞發揮抗感染和抗腫瘤免疫作用的主要亞群；而Vδ1 T細胞主要具有免疫調節功能[10]，目前認為與某些腫瘤，如乳腺癌的免疫逃逸相關。

γδT細胞因其獨特的組織相容性復合體（MHC）非限制性識別腫瘤抗原的特點而成為腫瘤免疫治療的研究熱點。本實驗通過觀察結直腸癌患者外周血和腫瘤組織γδ T細胞及各亞群的比例及功能變化情況，探討γδT細胞及各亞群在結直腸癌發病中的可能作用，為未來以γδT細胞為基礎免疫療法的應用提供一些科學依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月30日—2017年10月31日衢州市人民醫院接受手術治療的結直腸癌患者20例為癌癥組。所有入組者術前均未接受任何化學治療、放射治療或免疫治療；于術中收集癌癥組癌組織和癌旁組織標本，均經過組織病理學診斷證實為結直腸癌。同時收集該院健康體檢的20例作為對照組。癌癥組的平均年齡（51.09±13.26）歲，對照組的平均年齡（49.85±15.83）歲。標本的收集符合本院倫理委員會的要求。

1.2 主要試劑

RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司，FITC-抗人TCRγδ（IMMU510）以及抗人TCR-γδ單克隆抗體購自美國Beckman Coulter Immunotech公司，APC-c抗人CD3（HIT3a）、FITC-抗 人 TCR Vδ2（B6） 購自美國 Biolegend公司，FITC-抗人TCR Vδ1（TS8.2）購自美國Pierce公司，Cell TraceTMCFSE 細胞增殖 Kit 購自美國 Invitrogen公司，白細胞介素-2購自日本United Pharmaceutical（Far East）Limited 公司。

1.3 外周血單個核細胞獲取方法

清晨抽取兩組的外周血，以枸櫞酸鈉抗凝管收置；并以無菌RPMI 1640培養基稀釋1倍。按稀釋血液∶淋巴細胞分離液2∶1的比例計算淋巴細胞分離液體積，并于離心管中加入適量淋巴細胞分離液，隨后將稀釋后的外周血緩慢加入離心管中，并確保稀釋血置于淋巴細胞分離液上層，2 000 r/min 離心 20 min。離心后的血液分為4層，從上至下依次為：血清層、白膜層、淋巴細胞分離液層和紅細胞層。采用吸管輕輕吸取中間白色的淋巴細胞白膜層，加入預裝10 ml無菌RPMI 1640 培養基的離心管中，1 800 r/min 離心 15 min。棄盡無菌 RPMI 1640 培養基，以 10 ml無菌 RPMI 1640 培養基重懸細胞沉淀，1 500 r/min 離心 8 min。獲取的細胞即為外周血單個核細胞，可用于后續實驗。

1.4 T細胞獲取方法

結直腸癌組織以機械研磨的方法獲得T細胞，具體方法參見文獻[11]。

1.5 結直腸癌組織及外周血γδT細胞的培養

結直腸癌組織以機械研磨的方法獲得T細胞。抗凝外周血以Ficoll-PaqueTMPREMIUM分離獲得外周血單個核細胞。所獲T細胞及外周血單個核細胞以固相包被抗人TCR-γδ單克隆抗體（0.25 μg/cm2）進行刺激，所用培養基為含200 IU/ml白細胞介素-2及10%胎牛血清的RPMI 1640。細胞置于37℃、5%二氧化碳CO2條件下培養2～4周，其間每2～3天進行傳代。

1.6 表面分子的免疫熒光染色

收集約1×106個的外周血單個核細胞和T細胞，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（含1%牛血清白蛋白的PBS）洗滌1次。隨后采用50 μl PBS重懸細胞，根據抗體說明書要求加入適量熒光標記抗體，4℃避光孵育20 min。PBS洗滌2次，重懸于500 μl含1%多聚甲醛的PBS固定液中用于流式細胞儀檢測。

1.7 免疫抑制功能檢測

采用流式分選方法獲取經擴增后的Vδ1 T細胞和對照組外周血 Na?ve CD4 T 細胞。分選獲取的 Vδ1 T細胞和對照組外周血Na?ve CD4 T細胞經流式細胞術檢測純度 ＞90%。Vδ1 T 細胞抑制 Na?ve CD4 T 細胞增殖能力檢測時，需預先在96孔板中包被1 μg/mlCD3抗體及2 μg/ml CD 28 抗體，并放置在 37℃孵箱中孵育至少 2 h ；實驗過程中，Na?ve CD4 T 細胞按產品說明書進行 CFSE 染色，染色結束后 Na?ve CD4 T 細胞以 RPMI 1640完全培養基重懸后，加入96孔板中，進行Vδ1 T細胞抑制 Na?ve CD4 T 細胞能力檢測時，將Vδ1 T 細胞和Na?ve CD4 T細胞按1∶1比例加入96孔板中；各組細胞在37℃孵箱中孵育5 d后收取細胞用于流式細胞儀檢測。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血γδ T細胞比例

對照組和癌癥組外周血γδ T細胞比例為（5.7±1.9）%和（5.5±2.3）%，兩組比較，差異無統計學意義（t=0.300，P =0.766）；對照組和癌癥組外周血Vδ1 T細胞比例為（1.1±0.5）%和（3.2±0.9）%，兩組比較，差異有統計學意義（t=2.702，P=0.004），癌癥組外周血Vδ1 T細胞比例升高；對照組和癌癥外周血Vδ2 T細胞比例為（4.5±1.5）%和（2.2±0.7）%，兩組比較，差異有統計學意義（t=1.366，P=0.006），癌癥組外周血Vδ2 T細胞比例降低。見圖1。

2.2 癌癥組癌旁組織和癌組織γδ T細胞比例

癌旁組織和癌組織γδT細胞比例為（6.1±2.1）%和（5.9±2.2）%，兩者比較，差異無統計學意義（t=0.294，P=0.770）；癌旁組織和癌組織 Vδ1 T細胞比例為（1.1±0.5）%和（3.6±1.2）%，兩者比較，差異有統計學意義（t=1.059，P=0.008），癌組織 Vδ1 T細胞比例升高；癌旁組織和癌組織Vδ2 T細胞比例為（5.5±2.1）%和（2.8±1.4）%，兩者比較，差異有統計學意義（t=2.248，P=0.005）；癌組織 Vδ2 T 細胞比例降低。見圖2。

2.3 外周血及癌旁組織、癌組織γδT細胞增殖能力

對照組外周血γδT細胞經抗體擴增后，總γδT細胞比例為（86.8±14.2）%，Vδ1 T 細胞比例為（6.4±4.8）%，Vδ2 T細胞比例為（74.2±18.5）%；癌癥組外周血γδT細胞經抗體擴增后，總γδT細胞比例為（83.5±11.5）%，Vδ1 T 細胞比例為（41.5±8.4）%，Vδ2 T細胞比例為（28.4±15.3）%。與對照組比較，癌癥組總γδT細胞的擴增能力無改變（P＞0.05），而不同亞型的γδT細胞，即Vδ1 T細胞的擴增能力提高（t=10.529，P=0.007），Vδ2 T 細胞的擴增能力降低（t=8.532，P=0.004）。癌癥組癌旁組織 γδT 細胞經抗體擴增后，總γδT細胞比例為（85.3±18.3）%，Vδ1 T 細胞比例為（24.5±12.8）%，Vδ2 T 細胞比例為（55.3±15.2）%；癌癥組癌組織γδT細胞經抗體擴增后，總γδT細胞比例為（84.9±12.6）%。Vδ1 T 細胞比例為（60.6±13.7）%，Vδ2 T 細胞比例為（21.8±12.6）%。與癌旁組織比較，癌組織總γδ T 細胞的擴增能力無改變（t=0.081，P=0.936），而不同亞型的γδ T細胞，即Vδ1 T細胞的擴增能力提高，而Vδ2 T細胞的擴增能力降低。同時，結果顯示，癌癥組癌旁組織Vδ1 T細胞的擴增能力高于對照組外周血 Vδ1 T 細胞的擴增能力（t=10.315，P=0.004），而Vδ2 T細胞的擴增能力低于對照組外周血Vδ2 T細胞的擴增能力（t=8.734，P=0.002）。見圖3。

圖1 兩組外周血γδ T細胞比例

圖2 癌癥組癌旁組織和癌組織γδ T細胞比例

2.4 兩組Vδ1 T細胞的免疫抑制能力

對照組外周血Na?ve CD4細胞單獨的增殖能力為（90.7±15.7）%，Na?ve CD4細胞與對照組外周血Vδ1 T細胞共培養后，Na?ve CD4 細胞單獨的增殖能力為（67.5±11.4）%，Na?ve CD4細胞與癌癥組外周血Vδ1 T細胞共培養后，Na?ve CD4細胞單獨的增殖能力為（44.8±8.8）%，Na?ve CD4 細胞與癌旁組織 Vδ1 T細胞共培養后，Na?ve CD4細胞單獨的增殖能力為（52.8±7.9）%，Na?ve CD4 細胞與癌組織 Vδ1 T 細胞共培養后，Na?ve CD4細胞單獨的增殖能力為（33.6±7.7）%；癌癥組外周血和癌組織浸潤Vδ1 T細胞的免疫抑制功能較癌旁組織增強（t=6.067和5.179，P=0.002和0.003），癌旁組織Vδ1 T細胞的免疫抑制功能亦增強（t=4.872，P=0.003），但仍低于癌癥組外周血和癌組織的Vδ1 T細胞免疫抑制能力。見圖4。

圖3 外周血及癌旁組織、癌組織γδ T細胞的增殖能力

圖4 結直腸癌患者Vδ1 T細胞免疫抑制能力

3 討論

本研究結果顯示與對照組比較，癌癥組外周血、癌旁組織和癌組織總γδT細胞比例并未出現變化。γδT細胞主要分為2個細胞亞群：Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞[5]。對γδT細胞及其不同亞群的分析結果顯示，癌癥組外周血和癌組織的γδT細胞比例并未出現變化，而對不同亞群的分析結果顯示，Vδ1 T細胞比例升高，Vδ2 T細胞比例降低。且在體外經抗TCRγδ抗體刺激及IL-2存在條件下培養14 d后，對照組和癌癥組外周血、癌旁組織和癌組織的VδT細胞純度均可達80%以上，然而對照組的VδT細胞以Vδ2 T細胞為主，Vδ1 T細胞只占很小的一部分，癌癥組癌旁組織擴增后Vδ1 T細胞比例有一定程度升高，但仍以Vδ2 T細胞為主，而癌癥組外周血和癌組織的VδT細胞則以Vδ1 T細胞為主，Vδ2 T細胞只占很小的一部分。進一步功能實驗發現，結直腸癌患者外周血Vδ1 T細胞的免疫抑制功能增強。至此，筆者的研究結果初步提示，癌癥組外周血和癌組織中Vδ1 T細胞和Vδ2T細胞比例的分布不平衡，以及Vδ1 T細胞的異常活化狀態和抑制功能的增強，使癌癥組機體處于免疫抑制狀態，從而有利于腫瘤逃避免疫監視，進而促進腫瘤的發生和發展。

過繼免疫療法一直被研究者關注并用于癌癥的治療[12]。過繼免疫治療是將供體的淋巴細胞轉移給受體，增強其細胞免疫功能，使其獲得抗腫瘤免疫力。γδT細胞因其獨特的MHC非限制性抗原識別能力，同時兼具NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）和T輔助細胞（Th）的功能特點，因此成為腫瘤免疫治療的研究熱點[13]。γδT細胞包括2個主要的亞群，即Vδ1 T 細胞和Vδ2 T 細胞，其中的 Vδ2 T 細胞主要參與機體對腫瘤的免疫監視和對病原體侵襲的防御反應，因此Vδ2 T細胞過繼治療研究越來越多，多種腫瘤患者在化療后的合適時間給予Vδ2 T細胞和唑來磷酸可大幅度提高抗腫瘤療效[14]。同時，研究者發現Vδ1 T細胞在腫瘤患者體內主要發揮免疫抑制功能進而促進腫瘤的發展[15]。目前關于γδT細胞在結直腸癌的研究還很少，且很少有研究同時關注外周血、癌旁組織和癌組織。本研究亦希望通過對結直腸癌患者外周血、癌旁組織和癌組織中γδT細胞的研究為未來結直腸癌的過繼免疫治療提供一定的科學依據。

本研究通過流式細胞術檢測發現，與對照組比較，癌癥組外周血Vδ1 T細胞比例升高，Vδ2 T細胞比例降低。除外周血外，本研究還進一步對癌組織中γδ T細胞及其亞群進行分析，結果與外周血一致，與癌旁組織比較，癌組織Vδ1 T細胞比例升高，Vδ2 T細胞比例降低。此外，本研究還發現，在體外經擴增后癌癥組外周血和癌旁組織、癌組織的Vδ T細胞均以Vδ1 T細胞為主，Vδ2 T細胞只占很小的一部分。這一結果與結直腸癌患者外周血VδT細胞是以Vδ1 T細胞為主相一致。正如前言部分所介紹，Vδ2 T細胞是一種具有腫瘤殺傷功能的細胞，而Vδ1 T細胞則以免疫抑制功能為主。據此，本研究進一步對Vδ1 T細胞的免疫抑制功能進行研究，結果顯示，結直腸癌患者外周血和癌旁組織、癌組織的Vδ1 T細胞免疫抑制功能增強。

綜上所述，本研究結果初步提示，癌癥組外周血和癌組織Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞比例失衡，從而使患者機體處于免疫抑制狀態，這可能是結直腸癌逃避機體免疫監視的途徑之一。癌癥組外周血γδT細胞及不同細胞亞群的比例及功能變化可能與結直腸癌的發生和發展密切相關。