牙齦卟啉單胞菌促進4NQO誘導C57BL/6鼠食管鱗癌發生

劉其偉，許海軍，焦葉林，阮豪杰，陳 攀，谷變利，齊義軍，高社干

中國每年新增食管癌患者占全球一半以上，組織學上，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)占所有食管癌的90%以上[1]。由牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)誘發的宿主口腔微生態失衡不僅是慢性牙周炎和牙齒脫落的主要原因之一[2-3]，還與多種腫瘤的發生發展密切相關[4-5]。由于缺乏特異、敏感的早期診斷手段及分子標志物，目前中國確診的大部分食管癌(Esophageal cancer, EC)患者已發展至中晚期，導致預后極差[6]。近期研究表明口腔關鍵致病菌P.gingivalis、具核梭桿菌與ESCC分化、腫瘤轉移、化療耐藥、預后不良等臨床病理特征相關，但其詳盡的分子機制并不十分清楚[7-8]。本實驗以4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide，4NQO)誘導的C57BL/6鼠ESCC模型為基礎[9-10]，磨牙絲線結扎和P.gingivalis感染制備慢性牙周炎模型，明確P.gingivalis在ESCC模型鼠食管腫瘤發生過程中的作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組120只6周齡C57BL/6雄鼠購自常州卡文斯實驗動物有限公司，分為對照組、溶劑對照組、4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組等4組，每組各30只。120只鼠進入實驗室適應1周后，飲水中抗生素(甲硝唑、新霉素、氨芐青霉素和萬古霉素)處理2周，4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組飲水中50 μg·mL-14NQO處理8周。8周后對照組、溶劑對照組、4NQO組正常喂養，4NQO聯合P.gingivalis組小鼠上頜第二磨牙絲線結扎，P.gingivalis持續感染。實驗過程中，于22、26、30、34周等4個時間點分批處死小鼠，每次每組至少6只。

1.2 試劑使用及配制鼠飲水中甲硝唑、新霉素、氨芐青霉素濃度為0.2 g·L-1，萬古霉素濃度為0.1 g·L-1。4NQO試劑(Sigma，貨號N8141)，丙二醇(阿拉丁，貨號P103433)。0.5 g 4NQO粉劑溶于100 mL 1,2-丙二醇，配制溶度為5 mg·mL-1儲存液，4 ℃避光保存。小鼠飲水中4NQO終濃度為50 μg·mL-1。

1.3 C57BL/6小鼠牙周炎模型建立20%烏拉坦溶液(Sigma，貨號U2500-100G)，按小鼠體質量6 μL·g-1給藥，于顯微鏡下分別對小鼠左右上頜第二磨牙進行絲線結扎。取對數生長期P.gingivalis(OD 600吸光度1-1.7)，2 000 r·min-1離心10 min，2%羧甲基纖維素溶解P.gingivalis，濃度為2×1010·mL-1，取菌液50 μL涂抹于小鼠上頜磨牙區，隔天涂抹，連續涂抹2周后，每周涂抹2次。牙周炎建模完成后，分別于第14、18、24周連續對小鼠口腔進行拭子取樣檢測P.gingivalis。

1.4 小鼠飼養及樣本采集實驗過程中鼠房溫度為26 ℃，記錄小鼠進食、飲水、糞便、毛發以及活動度、精神狀態等，于22、26、30、34周對小鼠進行稱重、記錄。于第22、26、30、34周等4個時間點分別處死小鼠，每組至少6只，處死前對小鼠稱重、口腔拭子取樣，食管離體后沿縱軸剪開，觀察并記錄食管黏膜表面病變。實驗各組小鼠食管組織一半放置于福爾馬林溶液固定后脫水、包埋、切片，HE染色，另一半-80 ℃保存。

1.5 數據處理采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據處理分析，腫瘤面積采用Adobe Photoshop圖像處理軟件圈定，依據直尺刻度、按像素換算腫瘤面積大小，腫瘤病變面積比較采用t檢測，小鼠體質量變化比較采用方差分析，檢驗水準為P<0.05。

2 結果

2.1 實驗過程中小鼠體質量變化圖1顯示22、26、30、34周時各組小鼠處死時的體質量，其中對照組和溶劑對照組在各時間點上平均體質量變化不明顯，平均約30 g；26周時4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組體質量開始下降，隨著實驗進展，這兩組小鼠體質量逐漸降低，34周時降至最低；4組實驗鼠中，4NQO聯合P.gingivalis組降低尤其顯著，體質量最輕，實驗結束平均體質量為23.54 g。

圖1 22周、26周、30周和34周時各組實驗鼠處死時小鼠體質量

2.2 食管黏膜表面動態變化于22周時，4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組小鼠食管黏膜上皮粉紅色、粗糙、不規則乳頭狀增生，灶性分布，隨著實驗進展，上述病變逐漸加重；4NQO聯合P.gingivalis組小鼠的病變較4NQO單純處理組嚴重，灶性分布的乳頭狀增生數目最多，實驗結束34周時病變最明顯。對照組和溶劑對照組小鼠在整個實驗過程中，食管黏膜表面光滑、粉紅色、黏膜下血管紋理清晰，見圖2。

2.3 食管黏膜組織學動態變化食管組織HE染色可見，22、26、30、34周等4個時間點對照組和溶劑對照組上皮完整，基底細胞大小均一、排列整齊，未見明顯細胞增生。22周時，4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組鼠食管黏膜上皮開始增厚，基底細胞開始出現彌漫性增生；26周時，4NQO聯合P.gingivalis組鼠基底細胞出現灶性不典型增生，細胞層次增多，排列紊亂，極性消失，黏膜表面角化層出現灶性缺失，隨著實驗進展，不典型增生細胞增生為乳頭狀，突出于黏膜表面，黏膜表面角化層灶性缺失范圍增大。4NQO聯合P.gingivalis組小鼠的上述各種病變均較4NQO單純處理組嚴重。實驗36周結束時，4NQO聯合P.gingivalis組小鼠可見體積增大的癌細胞、排列不規則、異型性明顯，癌變細胞浸潤至肌層。

圖2 22周、26周、30周和34周時各組實驗鼠食管黏膜表面變化

圖3 22周、26周、30周和34周時各組實驗鼠食管組織學變化(HE, ×100)

2.4 食管黏膜病變面積和發病率實驗各組小鼠食管拭子Q-PCR檢測P.gingivalis感染及豐度，發現4NQO聯合P.gingivalis組內11只鼠，5只P.gingivalis陽性，鼠食管表面生物膜中P.gingivalis平均量為2.04×104。該組內P.gingivalis陽性小鼠食管黏膜病變面積明顯大于陰性鼠(圖4A)，陽性鼠肉眼見發病率也明顯高于P.gingivalis陰性鼠(圖4B)；4NQO聯合P.gingivalis組中P.gingivalis陽性小鼠食管黏膜病變面積(圖4C)和病變發生率(圖4D)也顯著高于4NQO組鼠。

3 討論

流行病學研究證實，約15%～20%的腫瘤起源于感染相關的慢性炎癥。慢性炎癥病灶微環境含有大量的氧自由基、細胞因子和生長因子，刺激局部細胞增殖，誘發細胞基因組不穩定，使正常細胞逐步發生惡性轉化。

目前觀點認為，人體各組織器官微生物群體，即微生態，是機體罹患疾病的重要原因之一[11]。人體消化道微生態紊亂不僅能夠引起口腔局部組織的破壞，還能夠調控免疫反應損傷遠處組織，誘發多種疾病的發生和進展，如慢性牙周炎、心血管疾病、多種腫瘤[12]。正常食管微生物組由鏈球菌等革蘭氏陽性菌為主的菌群構成，而Barrett’s食管和食管炎組織的微生物組轉變為革蘭氏陰性菌為主[13]。口腔微生態中有超過700種不同的細菌，ESCC患者口腔唾液中微生物多樣性降低，Prevotella、Streptococcus和Porphyromonas屬細菌豐度明顯增高[14]。另一項前瞻性研究表明，口腔唾液中P.gingivalis高豐度與ESCC患病風險呈正相關[15]。中國食管癌高發區ESCC組織中P.gingivalis豐度明顯高于癌旁組織，并且與癌細胞分化、淋巴結轉移、TNM分期和ESCC 患者生存期縮短顯著正相關[12]。上述研究表明：P.gingivalis可能是 ESCC發生發展的重要致病因素之一。

4NQO誘使DNA形成加合物，導致腺嘌呤和鳥嘌呤堿基替換。通過飲水給予模型鼠不同濃度4NQO，28周后能夠成功誘導大鼠和小鼠口腔及食管發生癌變，該模型已成功用于EC化學預防藥物的研究。50 μg·mL-14NQO飲水喂飼C57BL/6鼠8周，100%口腔和33%食管黏膜組織發生病變，100 μg·mL-14NQO飲水喂飼16周，100%口腔和食管均發生病變[16]。在此基礎上，本實驗應用50 μg·mL-14NQO飲水喂飼C57BL/6鼠8周后，磨牙絲線結扎制備慢性牙周炎模型，并給予P.gingivalis口腔局部涂抹，模擬人口腔P.gingivalis慢性持續感染。通過Q-PCR檢測食管黏膜生物膜中P.gingivalis感染，發現4NQO聯合P.gingivalis組中小鼠P.gingivalis感染率約為45.5%，證實口腔P.gingivalis可經吞咽至食管。22周時，4NQO組和4NQO聯合P.gingivalis組鼠食管黏膜病變開始逐步形成，隨著P.gingivalis持續作用，病變逐漸加重；36周實驗終止時，4NQO聯合P.gingivalis組3只小鼠發生癌變。實驗過程中各時間點，4NQO聯合P.gingivalis組小鼠食管黏膜病變面積和發病率均高于單純4NQO處理組，表明P.gingivalis能夠促進4NQO誘導的食管黏膜增生及癌變。與本實驗類似，4NQO(8周)聯合P.gingivalis和具核梭桿菌(18周)處理Balb/c雄鼠，發現P.gingivalis和具核梭桿菌顯著增加口腔舌黏膜病變嚴重程度和舌鱗癌發生率，并闡明這兩種細菌激活的IL-6/STAT3信號通路參與了舌鱗癌的發生發展過程[17]。

圖4 4NQO組和4NQO聯合P. gingivalis組內(A、B)及組間(C、D)P. gingivalis陽性和陰性鼠食管黏膜病變面積(A、C)及發病率(B、D)

本研究在4NQO誘導食管黏膜病變的基礎上，通過上頜磨牙絲線結扎和P.gingivalis感染制備慢性牙周炎模型，證實P.gingivalis能夠促進4NQO誘發的病變進展至癌變，為深入探討P.gingivalis促進ESCC發生發展分子機制和分子治療靶點提供了實驗動物模型。