ALDH1在食管鱗癌組織中的表達及與預后的關系

孔金玉，原 翔，劉怡文，孫 蔚，谷變利，蘭子君，高社干

中國是世界上食管癌發病率和病死率最高的國家，其中河南省是食管癌高發區[1]。食管癌中90%以上為鱗狀細胞癌[2]。腫瘤干細胞是腫瘤發生的始動細胞，是腫瘤發生、發展、侵襲、轉移、復發及耐藥的決定因素[3]。ALDH1在癌組織中的表達異常亦為眾多研究文獻所證實[4]。ALDH1在癌組織的表達情況，通常也提示腫瘤的惡性程度，并且與預后有關[5]。但目前很少有研究ALDH1在食管鱗癌組織中的表達及預測食管癌患者臨床預后的文獻報道。本研究通過檢測ALDH1在食管鱗癌組織中的表達情況，探討其與食管鱗癌的臨床病理特征和預后的關系，為食管癌早期診斷、分子靶向治療以及更為確切的預測臨床預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究為回顧性研究，收集2012年1月至2012年12月河南科技大學第一附屬醫院腫瘤科手術切除的食管鱗癌患者的組織標本100例，其中男62例，女38例；年齡42～79歲，平均61歲，中位年齡62歲；高分化26例，中分化56例，低分化18例；淋巴結轉移者28例；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期74例，Ⅲ期26例。腫瘤標本取自原發灶，取出后甲醛固定，石蠟包埋。所有患者均經病理學確診為食管鱗癌，且術前均未接受放化療及免疫治療，并于術前獲得患者書面知情同意。

1.2 主要試劑與儀器ALDH1兔抗人多克隆抗體(ab72543)購自美國Abcam公司；免疫組織化學SP超敏試劑盒、DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；檸檬酸抗原修復液(pH6.0)、蘇木精、中性樹膠購自索萊寶生物科技有限公司；光學顯微鏡購自尼康生物有限公司。

1.3 免疫組織化學法檢測食管鱗癌中ALDH1蛋白的表達取石蠟包埋的食管鱗癌組織標本,制成4 μm厚石蠟切片；于60 ℃溶蠟1.5 h，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、85%乙醇梯度水化，經0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液抗原高壓熱修復。用免疫組織化學SP試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司 SP-9000)檢測ALDH1蛋白表達。兔抗人ALDH1多克隆抗體濃度為1∶200。以0.01 moL·L-1的PBS(pH7.5)代替一抗作為陰性對照。觀察食管鱗癌組織中ALDH1蛋白的表達，以組織中顯示棕黃色為ALDH1表達陽性。根據組織切片胞質及胞核著色的強度和染色面積進行綜合評分，將“-”定為陰性，“+”“++”和“+++”定為陽性。

1.4 隨訪根據病歷信息記錄電話、地址等，采用門診及電話的方式進行隨訪，電話隨訪失敗，則通過地址單位及街道或村委會再次聯系隨訪，死于其他疾病、失訪或隨訪截止時間仍存活視為截尾數據，隨訪截止時間為2017年6月15日。100例患者中死亡60例，均死于食管癌相關的并發癥或復發、遠處轉移；失訪2例，失訪率為2.00%。總生存期(overall survival,OS)定義為從腫瘤確診起至末次隨訪或者任何原因引起的死亡。

1.5 統計學處理采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，采用卡方檢驗比較ALDH1在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理特征的相關性。應用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間的差異，以COX比例風險模型進行單因素和多因素分析，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ALDH1在食管鱗癌組織中的表達情況應用免疫組化SP法檢測100例食管鱗癌組織中ALDH1蛋白的表達。結果發現ALDH1蛋白質主要位于細胞質，陽性染色呈棕黃色顆粒；ALDH1在食管鱗癌組織中的陽性率為58.00%(58/100)，見圖1。

A：ALDH1陽性；B：ALDH1陰性。圖1 食管鱗癌組織中ALDH1的表達(DAB染色，×400)

2.2 ALDH1表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系應用χ2檢驗分析ALDH1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的相關性，結果發現ALDH1蛋白表達與腫瘤淋巴結轉移和臨床分期顯著相關(P<0.05)。有淋巴結轉移組中ALDH1陽性率為71.43%，顯著高于無淋巴結轉移組(45.83%)，差異具有統計學意義(χ2=5.302，P<0.05)。早期患者(Ⅰ期)中ALDH1蛋白表達陽性率為33.33%，顯著低于晚期(Ⅲ期)患者(84.62%)，差異具有統計學意義(χ2=13.670，P=0.001)。而食管鱗癌組織中ALDH1蛋白表達與年齡、性別及分化程度無顯著相關性，見表1。

表1 ALDH1蛋白表達與食管鱗癌患者臨床病理特征的關系 例(%)

2.3 ALDH1在食管鱗癌組織中的表達與預后的關系應用Kaplan-Meier繪制生存曲線并以Log-rank檢驗生存時間之間差異，分析ALDH1蛋白表達與食管鱗癌患者預后的相關性，結果發現100例食管鱗癌患者術后ALDH1蛋白陰性表達組5 a生存率(51.00%)明顯高于陽性組(23.00%)，提示ALDH1蛋白陽性組生存預后較差(χ2=8.623，P=0.003)。見圖2。

應用COX回歸分析100例成功完成術后隨訪的食管鱗癌患者，單因素分析結果顯示淋巴結轉移、臨床分期及ALDH1表達與總生存期相關(P<0.05)；COX多因素分析結果顯示，ALDH1表達是食管鱗癌獨立的危險因素(P<0.05)，見表2。

圖2 ALDH1表達在食管鱗癌中的生存曲線

表2 食管鱗癌患者預后影響因素的COX回歸分析

3 討論

食管癌在我國環太行山脈附近的省份明顯高發，其中河南林州是食管癌世界高發區[6],因食管癌早期臨床表現缺乏特異性，出現癥狀時大多已屬于晚期(Ⅲ/Ⅳ期)，往往錯過了最佳治療時期，預后較差，5 a生存率為30%[7]。隨著診療技術的不斷提高，食管鱗癌5 a生存率有所提高，但總體死亡率仍居高不下。因此，尋找具有特異性和敏感性的腫瘤標志物將有利于食管癌的早期發現，為食管癌治療提供可能的新靶點，具有極其重要的意義。

ALDH1位于細胞質，是一種含鋅酶類，可通過氧化視黃醇參與細胞的生長和分化。2007年Ginestier等[8]發現ALDH1是乳腺癌干細胞的標記物，揭開了ALDH1在干細胞領域研究的篇章。此后，在結直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、賁門癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤干細胞中均發現有ALDH1表達[9-14]。目前已證實ALDH1是結腸癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的通用標志物[15-18]。其與患者臨床治療及預后的相關性研究亦逐步展開。

本研究表明ALDH1位于細胞質中，食管鱗癌組織中有一定的高表達率(58.00%)，與現有ALDH1在其它腫瘤組織中的表達情況一致。同時有研究發現其在腫瘤組織中表達或活性與患者的預后具有顯著的相關性，Ma等[19]發現ALDH1高表達患者的預后明顯差于ALDH1低表達患者。宮頸癌組織中ALDH1高表達是一個獨立的危險因素，它預示著較低的生存率[20]，在頭頸部腫瘤方面Chen YC等[10]研究也發現，在頭頸部鱗癌的治療過程中AIDH1高表達患者顯示出明顯的治療耐受，而低表達患者在受到相同治療時，表現出較好的治療效果，且預后優于ALDH1高表達患者。本研究發現ALDH1蛋白的表達與腫瘤的臨床TNM分期和淋巴結轉移密切相關，提示ALDH1表達陽性的患者臨床分期晚、易于轉移。這與國外的研究基本一致[21-22]。同時，也說明了食管鱗癌干細胞具有較強的分化、生長能力，能夠直接導致患者的復發與遠處轉移。

本研究ALDH1表達、淋巴結轉移情況、TNM分期與患者生存率相關，是影響食管鱗癌患者生存率的獨立預后指標，這與國外的研究相同[23]。這也說明，ALDH1作為食管鱗癌腫瘤干細胞的標志物，能夠同淋巴結轉移、TNM分期一樣，預測食管鱗癌患者的臨床預后。

總之，ALDH1 在食管鱗癌中有高表達現象， 且其表達與患者的臨床預后密切相關。ALDH1表達與食管鱗癌預后關系的機制目前尚不明確，但是多種惡性腫瘤組織ALDH1過表達，而且ALDH1 蛋白陽性表達的患者總生存率低。ALDH1可能作為食管鱗癌腫瘤干細胞的標志物，且有望成為食管癌干細胞研究和靶向治療的新方向。