GSK3β對食管癌KYSE450細胞遷移、侵襲和克隆增殖方面調控作用的研究

原 翔，劉怡文，孫 蔚，孔金玉，張 灝，高社干

食管癌是我國常見的惡性腫瘤之一，每年發病人數約22萬，死亡人數約19萬[1]。其中90% 以上為食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]，河南省林州市、輝縣、安陽等地是我國食管癌發病率和死亡率最高的地區[3]。多數患者確診時已屬晚期或伴有遠處轉移，預后極差，5 a生存率極低[4]。目前，雖然對食管癌治療方面的研究已取得了很大進展，但仍沒有有效的治療方法。多年來，學者們一直致力于食管癌分子靶向治療研究，以預測其發生、發展、轉移及預后情況。

糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3,GSK3)是一個廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括GSK3α和GSK3β兩種亞型。二者具有85%的同源性，催化結構域具有93%同源性，但在哺乳動物中執行不同的功能[3]。GSK3β是多種信號轉導通路中的關鍵激酶之一，主要參與慢性炎癥的調控，并與多種腫瘤的發生發展密切相關[4-15]。本研究采用Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實驗等方法檢測GSK3β對食管癌KYSE450細胞惡性生物學行為的影響，并分析其調控作用及意義，為食管鱗癌的分子靶向治療提供新的靶點和思路,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑食管癌KYSE450細胞系(上海博古生物細胞所)；RPMI-1640培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；胰酶、青鏈霉素(中國索萊寶公司)；慢病毒包裝試劑盒(美國selleck公司)。

1.2 細胞系培養常規細胞系培養：食管癌KYSE450細胞系，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基，于37 ℃、5%CO2的培養箱中常規培養；2～3 d換液、傳代1次，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 慢病毒載體包裝常規培養293T細胞，密度至50%～60%時，開始轉染。配制“DNA質粒-EndoFectin”混合物，室溫放置30 min。將混合物加入293T細胞，5%CO2、37 ℃恒溫箱孵育8～14 h，向培養基中加入1/500體積的“Titer Boost”。分別于48、96 h收獲病毒，將細胞上清至0.45 μm濾器去除細胞碎片，取上清(立即進行感染)。將目的細胞鋪板，待密度長至50%～60%時，直接加入含病毒的培養基進行轉染。轉染病毒后，每天在熒光顯微鏡下觀察信號。待視野中大部分細胞都帶有熒光時，用嘌呤霉素或潮霉素進行篩選。提取細胞蛋白質，通過Western blot檢測轉染效率。

1.4 Western blot方法檢測GSK3β蛋白敲降效率將對數生長期的KYSE450細胞消化下來后，分成兩組，即450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)應用慢病毒包裝試劑盒進行GSK3β蛋白敲降處理，并篩選穩定細胞系。然后將兩組細胞提取新鮮蛋白質，進行Western blot檢測GSK3β的表達。具體步驟為：提取細胞蛋白質后，用BCA法進行蛋白質定量(康為公司)。用10%SDS-PAGE凝膠進行上層膠恒壓90 V 30 min，下層膠恒壓120 V 60 min電泳，切膠后采用“三明治夾心法”，恒壓90 V 150 min轉膜，5% 脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，TBST 清洗1次，每次30 s，加入GSK3β兔一抗(1∶1 000，Abcam)和內參GAPDH(1∶2 000，康為公司)4 ℃過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入兔二抗(1∶2 000，康為公司)室溫孵育2 h，再用TBST漂洗3次，每次5 min，采用ECL(美國Invitrogen公司)檢測目的蛋白條帶，凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)采集圖像并進行定量分析。

1.5 細胞功能學實驗①通過Wound-healing實驗比較各組細胞不同時間點遷移面積的大小。將對數生長期的細胞經胰蛋白酶消化后制成5×103·mL-1的單細胞懸液，分為兩組，450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，分別于0 h和24 h對同一位置細胞拍照，比較兩組細胞24 h遷移面積。應用Image J軟件測量不同時間點劃痕內空白面積的大小，并用以下公式計算遷移面積：遷移面積(n h)=空白面積(0 h)-空白面積(n h)，進而比較各組細胞不同時間點遷移面積的大小，采用t檢驗，分析各組之間差異，檢測腫瘤細胞的體外遷移能力。②通過Transwell實驗比較各組細胞降解基質，向深層侵襲的數量。實驗分為450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，每組鋪2個平行對照，分別于16 h和24 h固定1組細胞拍照并計數穿過下層膠細胞數量，采用t檢驗，分析各組之間差異，檢測腫瘤細胞的體外侵襲能力。③通過平板克隆形成實驗檢測細胞形成單克隆的數量。實驗分為450-GFP(對照組)與450-1(GSK3β敲降組)，設置兩個細胞鋪板密度，分別于6孔板中鋪入500個細胞和1 000個細胞，采用t檢驗，分析各組之間差異，檢測腫瘤細胞的體外增殖及克隆形成能力。

1.6 統計學處理運用SPSS 23.0對數據進行統計學處理。Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實驗結果分析采用配對樣本t檢驗。以GrapPad Prism5.0統計繪圖軟件處理、分析數據、繪制圖形。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot方法檢測GSK3β蛋白敲降效率通過Western blot檢測GSK3β蛋白的表達，結果顯示，450-1(GSK3β敲降組)組中GSK3β蛋白表達被顯著抑制。

圖1 Western blot顯示敲降組中GSK3β蛋白表達顯著被抑制

2.2 Wound-healing實驗通過Wound-healing實驗檢測腫瘤細胞的體外遷移能力。結果顯示，與450-GFP(對照組)相比，450-1(GSK3β敲降組)細胞24 h遷移面積顯著變小(t=11.66，P<0.05，圖2)，其體外遷移能力明顯減弱。

圖2 GSK3β對食管癌細胞系遷移能力的影響

2.3 Transwell實驗結果通過Transwell實驗檢測GSK3β對食管癌細胞系侵襲能力的影響，結果顯示，與450-GFP(對照組)相比，450-1(GSK3β敲降組)16 h(t=3.31，P<0.05，圖3)及24 h(t=4.80，P<0.05，圖3)穿過下層膠細胞數目顯著減少，其體外侵襲能力明顯減弱。

圖3 GSK3β對食管癌細胞侵襲能力的影響

2.4 平板克隆實驗結果采用平板克隆實驗檢測GSK3β對食管癌細胞系體外克隆增殖能力的影響，結果顯示，與450-GFP(對照組)相比， 450-1(GSK3β敲降組)500個細胞(t=8.69，P<0.05，圖4)和1 000個細胞(t=6.85，P<0.05，圖4)的細胞克隆數均顯著減少，其細胞克隆增殖能力明顯減弱。

3 討論

GSK3β是多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，不僅可通過抑制磷酸化糖原合酶的活性升高機體血糖濃度，還可通過調控多種轉錄因子的活性/穩定性(如AP-1、NF-κB、c-Myc、β-catenin、P53和STATs)而參與多種腫瘤相關病理過程，包括細胞增生、分化、遷移、凋亡、黏附及產生炎癥因子等。因此，GSK3β與多種腫瘤的發生發展關系密切。然而，GSK3β在腫瘤發生及演進過程中的作用，目前報道不一。在骨肉瘤、肝癌、卵巢癌、結直腸癌、胰腺癌、白血病等腫瘤中能夠促進腫瘤發生發展，而在肺癌、口腔癌、皮膚癌、乳腺癌中，則可抑制腫瘤惡性進展[5-13]。

圖4 GSK-3β對食管癌細胞系克隆增殖能力的影響

本研究通過Wound-healing、Transwell、平板克隆形成實驗等方法檢測GSK3β對食管癌KYSE450細胞惡性生物學行為的影響，發現在食管癌KYSE450細胞系中，對GSK3β進行下調時，其遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學行為顯著減弱，差異有統計學意義(P<0.05)。Li RL等[14]檢測GSK3β在前列腺癌中的表達，發現GSK3β表達與前列腺癌臨床病理分期、Gleason評分及淋巴結轉移顯著相關，表明GSK3β高表達與前列腺癌侵襲轉移及惡性進展相關。周曉波等[15]檢測GSK3β在正常食管上皮及食管癌組織中的表達，發現GSK3β在食管癌組織中表達明顯升高，并與淋巴結轉移顯著相關，提示GSK3β高表達與食管癌侵襲轉移及惡性進展相關。上述兩項研究均與本研究結果有一致性，即GSK3β高表達可顯著促進腫瘤遷移、侵襲等方面惡性生物學進展。但本研究更深入探討了敲降GSK3β后，食管癌細胞KYSE450體外遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學行為顯著減弱，更明確了GSK3β可能為食管癌治療的潛在分子靶點。

綜上所述，本研究發現在食管癌細胞KYSE450中，對GSK3β進行下調時，其遷移、侵襲及克隆增殖方面惡性生物學行為均顯著減弱。抑制GSK3β的表達能顯著抑制食管癌細胞的惡性生物學行為，提示GSK3β可能成為食管癌治療的新指標，并為食管癌的治療提供新的靶點。