補(bǔ)骨脂多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

尹震花，張娟娟，陳 林，郭慶豐，張 偉，康文藝,*

（1.黃河科技學(xué)院 鄭州市天然產(chǎn)物合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市藥用資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450063；2.河南省小分子新藥研發(fā)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450063）

多糖是廣泛存在于動(dòng)植物、真菌及藻類中的一種生物大分子，具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗血栓等多種藥理活性[1-5]。補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，為傳統(tǒng)中藥[6]。按照《衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2002]51號(hào)），補(bǔ)骨脂可用于保健食品。現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂含有香豆素類、黃酮類、單萜類等多種成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種功效[7-8]。關(guān)于補(bǔ)骨脂多糖（Psoralea corylifolia polysaccharides，PPs），目前僅國(guó)內(nèi)幾位學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地補(bǔ)骨脂粗多糖的含量及免疫活性進(jìn)行了初步研究[9-12]，鮮見(jiàn)對(duì)補(bǔ)骨脂粗多糖的純化、結(jié)構(gòu)分析及其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力影響的研究。水提取的粗多糖溶液中含有色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，直接測(cè)定影響其活性及結(jié)構(gòu)鑒定[13]，因此需對(duì)補(bǔ)骨脂粗多糖進(jìn)行分離純化。

本研究以補(bǔ)骨脂為材料，采用熱水提取、乙醇沉淀的方法從補(bǔ)骨脂中提取粗多糖，采用Sevag法除蛋白，經(jīng)DEAE-52和Sephadex G-100柱色譜分離，對(duì)分離純化得到的多糖的一般理化性質(zhì)、單糖組成、摩爾質(zhì)量進(jìn)行研究，并采取多種光譜手段表征其結(jié)構(gòu)，同時(shí)評(píng)價(jià)其對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響，旨在為更好地開(kāi)發(fā)和利用補(bǔ)骨脂中的多糖組分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

補(bǔ)骨脂（批號(hào)：170703，產(chǎn)地：發(fā)徽亳州）于2018年9月購(gòu)買于河南省鄭州市張仲景大藥房，經(jīng)河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，標(biāo)本存放于黃河科技學(xué)院天然藥物研究室。

小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞科學(xué)研究所；石油醚、無(wú)水乙醇 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；濃硫酸 開(kāi)封方晶化工廠；苯酚天津凱通化學(xué)試劑有限公司；不同摩爾質(zhì)量的葡聚糖（T-40、T-64、T-150、T-250、T-500） 德國(guó)Sigma-Aldrich公司；D(+)-葡萄糖、D(+)-木糖、L(+)-阿拉伯糖、L(+)-鼠李糖、D(+)-甘露糖、D-半乳糖 德國(guó)Dr Ehrenstorfer GmbH公司；DEAE-52纖維素 賽譜銳思（北京）科技有限公司；Sephadex G-100 瑞典GE Healthcare Bio-Science AB公司；三氟乙酸、硼氫化鈉阿拉丁試劑（上海）有限公司；超純水 實(shí)驗(yàn)室自制；Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM） 北京Solarbio科技有限公司；胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；透析袋（相對(duì)分子質(zhì)量8 000～14 000） 上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LL-1500型冷凍干燥儀器、TRACE 1310氣相色譜儀、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀特特世科技（上海）有限公司；Bruker Avanced III400 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀德國(guó)Bruker公司；場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI Quanta 250 FEG公司；傅里葉變換紅外光譜儀美國(guó)Nicolet公司；EnVision多標(biāo)記微孔板檢測(cè)系統(tǒng)美國(guó)PerKinElmer公司；分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取

補(bǔ)骨脂稱質(zhì)量4.4 kg，粉碎，石油醚浸提脫脂3 次，每次3 d，殘?jiān)鼡]發(fā)干石油醚，用70%乙醇溶液浸提3 次，每次3 d，殘?jiān)鼡]發(fā)至無(wú)醇味，加入一定量蒸餾水，于（85±2）℃提取3 次，每次4 h，合并、過(guò)濾、濃縮至原體積的1/4，加入無(wú)水乙醇調(diào)至乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置，4 000 r/min離心8 min，回集沉淀，冷凍干燥得到補(bǔ)骨脂粗多糖。

1.3.2 粗多糖的分離純化

采用S e v a g法[14]除去粗多糖中的蛋白，重復(fù)4 次；除蛋白后的多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜（60 cm×2.5 cm）分離，超純水、0.05 mol/L NaCl溶液洗脫，經(jīng)苯酚-濃硫酸法隔管檢測(cè)，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，繪制多糖洗脫曲線，同一洗脫峰進(jìn)行合并、透析袋透析；再經(jīng)Sephadex G-100柱色譜（100 cm×1.5 cm），超純水洗脫，每5 min一管，苯酚-濃硫酸法隔管檢測(cè)，490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，合并、凍干純化得到的多糖。

1.3.3 純化后多糖的一般理化性質(zhì)

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定多糖的總糖含量[15]；通過(guò)考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行蛋白質(zhì)分析[16-17]；參考文獻(xiàn)[18]，測(cè)定純化后的多糖在熱水、冷水以及乙醇、正丁醇、丙酮、氯仿、石油醚等有機(jī)溶劑中的溶解度，觀察溶解性；進(jìn)行斐林試劑反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)。

1.3.4 單糖組成分析

按照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的多糖水解、乙?；吧V條件等，進(jìn)行單糖組成分分析。純化多糖8 mg在110 ℃下用2 mL 4 mol/L的三氟乙酸水解3 h得到水解產(chǎn)物，水解產(chǎn)物與8 mg鹽酸羥胺和0.4 mL吡啶在90 ℃反應(yīng)30 min，再用0.4 mL乙酸酐在90 ℃乙?；?0 min得到乙?；a(chǎn)物。采用氣相色譜法進(jìn)行單糖檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)單糖也用同樣的方法衍生得到乙?；a(chǎn)物。

1.3.5 摩爾質(zhì)量的測(cè)定

分離純化得到的PPs摩爾質(zhì)量采用HPLC法測(cè)定。色譜條件：Waters液相色譜儀配示差折光檢測(cè)器；色譜柱為TSK G4000PWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm，17 μm）；流動(dòng)相為純凈水，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃；測(cè)定方法：分別取摩爾質(zhì)量為4×104、6.4×104、1.5×105、2.5×105g/mol和5×105g/mol的葡聚糖對(duì)照品100 mg，用純凈水定容至10 mL，過(guò)0.22 μm水系膜，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰保留時(shí)間（tR），以標(biāo)準(zhǔn)摩爾質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以tR為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品分別以超純水制成10 mg/mL溶液，在同樣色譜條件下進(jìn)樣，記錄樣品保留時(shí)間，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品摩爾質(zhì)量。

1.3.6 多糖紅外光譜測(cè)定

取適量的補(bǔ)骨脂純化多糖，置于瑪瑙研缽中，加入適量干燥KBr粉末，研磨混合，壓片后測(cè)定紅外光譜，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.7 多糖NMR氫譜（1H-NMR）和碳譜（13C-NMR）分析

取15～20 mg補(bǔ)骨脂純化多糖，用500 μL D2O溶解后加入核磁管中，經(jīng)布魯克400 MHz NMR波譜儀，25 ℃測(cè)定其1H-NMR和13C-NMR。

1.3.8 多糖微觀結(jié)構(gòu)分析

在真空濺射鍍膜機(jī)中，將干燥的多糖固定在金屬短柱上并噴金，用掃描電子顯微鏡觀察補(bǔ)骨脂純化多糖的微觀結(jié)構(gòu)，放大倍數(shù)50 000，標(biāo)尺2 μm。

1.3.9 多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)補(bǔ)骨脂純化多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的活力影響[20]。將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96 孔板中（1×105/孔），CO2環(huán)境下37 ℃培養(yǎng)24 h。而后用一系列濃度的多糖溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。每孔加入10 μL MTT，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶被還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶，在490 nm波長(zhǎng)處有吸回。通過(guò)比較陰性對(duì)照組（僅培養(yǎng)基）的吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，評(píng)價(jià)2 個(gè)多糖對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPs的提取、分離與純化

圖1 補(bǔ)骨脂粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱色譜洗脫曲線Fig. 1 Elution curve of crude polysaccharides by DEAE-52 cellulose column chromatography

圖2 PPs-1（a）和PPs-2（b）經(jīng)Sephadex G-100柱色譜洗脫曲線Fig. 2 Elution curves of PPs-1 (a) and PPs-2 (b) by Sephadex G-100 column chromatography

補(bǔ)骨脂經(jīng)石油醚脫脂、70%乙醇溶液提取、熱水提醇沉、除蛋白等一系列處理后，PPs得率為1.59%，蛋白質(zhì)除去率為90.74%。經(jīng)DEAE-52色譜柱分離，以0.05 mol/L NaCl洗脫時(shí)，得到2 個(gè)明顯主峰，洗脫曲線見(jiàn)圖1，分別合并命名為PPs-1和PPs-2。PPs-1和PPs-2經(jīng)Sephadex G-100色譜柱進(jìn)一步純化，洗脫曲線見(jiàn)圖2?？梢钥闯觯琍Ps-1和PPs-2經(jīng)純化后均得到1 個(gè)對(duì)稱峰，合并濃縮、透析、凍干得到白色粉末，分別命名為PPs-1-1和PPs-2-1。

2.2 多糖的一般理化性質(zhì)

表1 PPs-1-1和PPs-2-1的一般理化性質(zhì)Table 1 General physicochemical properties of PPs-1-1and PPs-2-1

從表1可以看出，PPs-1-1和PPs-2-1均具有多糖的一般理化性質(zhì)[21]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-濃硫酸法測(cè)定2 種多糖中的總糖含量，結(jié)果顯示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝5.964x-0.003 6，相關(guān)系數(shù)r＝0.995，其中y為吸光度，x為葡萄糖質(zhì)量濃度，PPs-1-1和PPs-2-1總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（94.35±0.23）%和（95.27±0.42）%。

2.3 單糖組成成分分析

PPs-1-1和PPs-2-1經(jīng)三氟乙酸水解、乙酸酐乙?；?、氯仿萃取后，樣品直接進(jìn)入氣相色譜進(jìn)行分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖乙酸酐乙?；蟮谋Ａ魰r(shí)間進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖3、4。結(jié)果表明，從PPs-1-1中鑒定出6 種單糖：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其物質(zhì)的量比為2.08∶2.43∶1.60∶1.15∶0.673∶13.90；同樣，PPs-2-1中也鑒定出6 種單糖，其物質(zhì)的量比為2.49∶1.14∶1.99∶0.336∶0.612∶5.72。

圖3 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的氣相色譜圖Fig. 3 GC chromatograms of mixed standard monosaccharides

圖4 PPs-1-1（a）和PPs-2-1（b）的氣相色譜圖Fig. 4 GC chromatograms of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b)

2.4 多糖的摩爾質(zhì)量分析

利用HPLC法測(cè)定PPs-1-1和PPs-2-1摩爾質(zhì)量，如圖5所示，均為均一單峰。根據(jù)葡聚糖Dextran系列得到回歸方程為：lgmw＝-0.634tR+10.25，R2＝0.974。根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算出PPs-1-1和PPs-2-1的摩爾質(zhì)量為3.98×106g/mol和4.47×106g/mol。

圖5 PPs-1-1（a）和PPs-2-1（b）的HPLC圖Fig. 5 HPLC profiles of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b)

2.5 紅外光譜分析

由圖6可以看出，在3 400 cm-1附近有一個(gè)寬展圓滑強(qiáng)吸回峰（PPs-1-1：3 405 cm-1；PPs-2-1：3 420 cm-1），為O—H伸縮振動(dòng)峰，由糖分子內(nèi)或分子間O—H伸縮振動(dòng)引起的吸回；在2 934、2 937 cm-1處分別出現(xiàn)1 個(gè)很弱的特征吸回峰，即為C—H伸縮振動(dòng)的吸回峰[22-23]，這些區(qū)域的吸回峰是糖類的特征吸回峰；1 615 cm-1左右（PPs-1-1：1 617 cm-1；PPs-2-1：1 613 cm-1）吸回峰為C＝O的伸縮振動(dòng)峰，1 420 cm-1左右弱吸回峰（PPs-1-1：1 420 cm-1；PPs-2-1：1 417 cm-1）為C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰[24]。呋喃糖在1 100～1 010 cm-1范圍內(nèi)有2 個(gè)吸回峰，吡喃糖在1 100～1 010 cm-1范圍內(nèi)有3 個(gè)吸回峰，表明PPs-1-1和PPs-2-1分別含有呋喃和吡喃糖環(huán)[25]；890 cm-1左右有弱的特征吸回，證實(shí)糖殘基的連接中存在β-糖苷鍵，840 cm-1左右較弱的吸回信號(hào)，證實(shí)α-糖苷鍵的存在[26]。

圖6 PPs-1-1（a）和PPs-2-1（b）紅外光譜圖Fig. 6 FT-IR spectra of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b)

2.6 NMR譜圖分析

圖7 PPs-1-1（a）和 PPs-2-1（b）的NMR圖譜Fig. 7 NMR spectra of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b)

由圖7的1H-NMR圖譜可以看出，δ?5.60～4.90和δ?4.90～4.30分別歸屬于α-和β-構(gòu)型的異頭質(zhì)子，而δ?4.50～3.00歸屬于環(huán)質(zhì)子區(qū)[27]，證實(shí)了骨架中存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵，這與紅外光譜分析結(jié)果一致。由圖7的13C-NMR圖譜可以看出，在δ?176～170范圍內(nèi)的信號(hào)歸屬于羧基碳，說(shuō)明PPs-2-1含有糖醛酸，δ?110～90歸屬于端基碳，δ?90～60歸屬于非端基碳[28]。

2.7 微觀結(jié)構(gòu)分析

圖8 PPs-1-1（a）和PPs-2-1（b）的掃描電鏡圖Fig. 8 Photomicrographs of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b) as recorded by SEM

由圖8可以看出，PPs-1-1呈三維層狀結(jié)構(gòu)，表面光滑且致密；PPs-2-1呈多層狀結(jié)構(gòu)，表面疏松多孔，有顆粒聚集。PPs-1-1和PPs-2-1是非晶態(tài)固體，結(jié)果與實(shí)際得到的固體一致。這種微觀結(jié)構(gòu)的差異可能與排斥力有關(guān)，可能導(dǎo)致分子聚集，另外還可能和多糖具有側(cè)鏈有關(guān)[29]。

2.8 對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響

由圖9可知，與空白相比，在質(zhì)量濃度0.01～0.16 μg/mL范圍內(nèi)，PPs-1-1可增大RAW264.7巨噬細(xì)胞活力，且隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力先增大后逐漸降低，均大于100%；與PPs-1-1相似，與空白相比，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.01 μg/mL時(shí)，PPs-2-1對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力也具有激活作用，細(xì)胞活力大于100%。當(dāng)PPs-1-1和PPs-2-1質(zhì)量濃度分別大于0.16 μg/mL和0.01 μg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞活力不斷降低?？梢缘贸觯琍Ps-1-1和PPs-2-1在質(zhì)量濃度分別低于0.16 μg/mL和0.01 μg/mL范圍內(nèi)，可增大RAW264.7巨噬細(xì)胞活力，表現(xiàn)出激活活性。

圖9 PPs-1-1（a）和PPs-2-1（b）對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響Fig. 9 Effects of PPs-1-1 (a) and PPs-2-1 (b) on cell viability of RAW264.7 macrophages

3 結(jié) 論

利用熱水提取乙醇沉淀、除蛋白等處理后，再經(jīng)DEAE-52纖維素色譜柱0.05 mol/L NaCl溶液洗脫和Sephadex G-100柱色譜從PPs中分離純化得到了2 種多糖（PPs-1-1和PPs-2-1），具有類似的理化性質(zhì)，均是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，但其物質(zhì)的量比不同；平均摩爾質(zhì)量分別為3.98×106、4.47×106g/mol；PPs-1-1具有表面光滑且致密的三維層流結(jié)構(gòu)，具有α-和β-構(gòu)型的呋喃糖苷，具有α-和β-糖苷鍵。PPs-2-1具有表面疏松多孔的層狀結(jié)構(gòu)，具有β-構(gòu)型的吡喃糖苷。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)表明，在PPs-1-1和PPs-2-1質(zhì)量濃度分別低于0.16 μg/mL和0.01 μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活力有激活作用。本研究可為PPs的進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。