130例梅毒篩查檢測弱反應性結果分析

王欣俞，丁曉娜，趙晉文，崔 凱，潘 杰，王鑫琪，張延海，高德祿，郭奕陽，馬海娜※

(1.河北燕達醫院檢驗科，河北 廊坊 065201； 2.河北燕達醫學研究院，河北 廊坊 065201；3.河北醫科大學第四醫院檢驗科，石家莊 050011)

梅毒是由梅毒螺旋體(treponema pallidum，TP)感染引起的一種慢性、系統性性傳播疾病[1]。其可侵犯全身機體，導致急性皮膚感染、生殖器潰瘍、脊髓病變、主動脈瓣關閉不全、主動脈瘤、麻痹性癡呆、視神經萎縮，嚴重情況下可導致患者死亡[2-3]。梅毒的傳染途徑主要為性接觸，其可呈現進展型發病趨勢，但臨床癥狀和體征不具有特異性，故加強早期診斷意義重大[4]。TP侵襲力極強，可破壞患者表皮或黏膜屏障的完整性，使人類免疫缺陷病毒更易進入和排出宿主，導致梅毒患者感染或傳播人類免疫缺陷病毒的風險增加4～5倍，從而促進人類免疫缺陷病毒的感染和傳播[5]。由于TP具有無法在體外連續培養、基因操作困難、細胞膜易碎難以提取等缺點[6]，也無有效疫苗，故早期篩查與診斷梅毒具有重要價值[7]。目前，梅毒的診斷主要依據臨床表現和實驗室檢查，實驗室檢查包括梅毒的暗視野顯微鏡檢查、梅毒血清學檢測、梅毒聚合酶鏈反應檢測等。由于梅毒暗視野顯微鏡檢查和梅毒聚合酶鏈反應檢測受實驗條件、梅毒病程影響，檢出率不高，所以臨床最常用的檢測方法為梅毒血清學檢測[8]。本研究通過分析130例梅毒篩查弱反應性結果，旨在探討實驗室檢測方法在臨床結果判讀診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性納入2018年1月至2019年6月在河北燕達醫院體檢中心、門診和住院部進行全自動化學發光微粒子免疫分析法(chemiluminescence microparticle immunoassays，CMIA)梅毒實驗室血清篩查的38 331例患者，選取S/CO值1～9弱反應性且快速血漿反應素環狀卡片試驗檢測均為陰性的130例患者作為研究對象，其中男62例，女68例，年齡28～89歲，平均(57±13)歲，年齡集中在45～60歲。人群分布：老年人31例，男15例，女16例；神經系統相關疾病24例，男11例，女13例；心血管相關疾病23例，男15例，女8例；腫瘤相關性疾病19例，男10例，女9例；孕婦14例；感染性相關疾病8例，男3例，女5例；風濕免疫相關性疾病7例，男5例，女2例；體檢人群4例，男3例，女1例。

1.2試劑與儀器 CMIA檢測試劑(批號：9331LI00)由美國雅培公司生產，其配套儀器為全自動微粒子化學發光免疫分析儀(美國雅培公司，型號：Architect i2000SR)；化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)檢測試劑(批號：128058)由德國西門子公司生產，其配套儀器為全自動化學發光免疫分析儀(德國西門子公司，型號：ADVIA Centaur XP)；梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(treponema pallidumm particle agglutination，TPPA)檢測試劑購自日本富士瑞必歐株式會社(批號：WN81019)；梅毒螺旋體免疫印跡試驗(treponema pallidum-western blot，TP-WB)檢測試劑盒購自德國歐蒙公司(批號：D180619AG)。梅毒實驗室檢測按標準化操作文件執行。檢測樣本時，同測室內質控品及陰、陽性對照，以保證監控檢測質量。

1.3方法 采用CMIA初篩檢測TP特異性抗體，快速血漿反應素環狀卡片試驗排除梅毒活動期，選用TPPA和CLIA進行復核，以TP-WB為金標準確證方法。CMIA法試劑說明書中，以S/CO值(樣本RLU/cut-off RLU)≥1檢驗結果解釋TP抗體檢測呈反應性，S/CO值<1檢驗結果解釋TP抗體檢測呈非反應性；快速血漿反應素環狀卡片試驗測定梅毒非特異性抗原，是檢測梅毒現正感染和療效監測的指標。快速血漿反應素環狀卡片試驗陽性反應判讀可見中等或較大的黑色凝塊，溶液清亮；陰性反應判讀可見均勻的抗原顆粒而無凝集物。TPPA和CLIA為TP特異性抗體復檢方法(TPPA陽性反應判讀產生均一的凝集，顆粒鋪滿整個孔底邊緣不均勻且雜亂地凝集在周圍，整體上呈膜狀延展；陰性反應判讀反應物集中于孔底，成紐扣狀聚集，邊緣光滑的圓形。CLIA S/CO值≥1檢驗結果解釋TP抗體檢測呈反應性，S/CO值<1檢驗結果解釋TP抗體檢測呈非反應性)。TP-WB為實驗室平行試驗的金標準，檢測方法中重組TP基因蛋白抗原采用TPN47、tmpA(TPN45)、TPN17、TPN15的IgG抗體，是測定的血清特異性抗體。檢測膜條置于全自動免疫印跡儀EUROBlotMasterll檢測，通過EUROLineScan軟件對檢測結果進行判讀，至少兩條特異性抗原帶明確顯色，測試判讀陽性；一條特異性抗原帶明確顯色，測試判讀可疑陽性。EUROLineScan軟件判讀結果標準為著色強度≥24判定有反應性，檢測線性范圍為0～255。

1.4統計學方法 采用Graphpad Prism 8 Contingency table analyses組件的χ2檢驗進行不同診斷方法的差異分析；相關性分析采用Excel 2016進行散點最小二乘擬合，得到線性關系式并計算相關系數。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.14種梅毒實驗室方法檢測結果比較 130例CMIA初篩梅毒檢測的S/CO值為1～9弱反應性樣本，以CLIA復核，92例陽性，38例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.586，特異度為1.000，差異有統計學意義(χ2=44.532，P<0.001)；以TPPA復核，98例陽性，32例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.570，特異度為1.000，差異有統計學意義(χ2=36.491，P<0.001)；TPPA復核結果和CLIA方法相比，靈敏度為0.516，特異度為0.543，差異無統計學意義(χ2=0.704，P=0.402)；以TP-WB平行檢測作為確證方法，40例反應性結果，其中8例陽性，32例可疑陽性，90例陰性，與CMIA相比，靈敏度為0.942，特異度為1.000，差異有統計學意義(χ2=229.943，P<0.001)。以TP-WB梅毒血清方法學為金標準，CLIA法靈敏度為85.0%，特異度35.6%；TPPA法靈敏度為85.0%，特異度為28.9%。見表1。

表1 CLIA、TPPA和TP-WB檢測TP抗體的結果 (例)

CLIA：化學發光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗；TP-WB：梅毒螺旋體免疫印跡試驗；TP：梅毒螺旋體

2.2CMIA與CLIA法的相關性分析 130例弱反應性結果分別采用CMIA及CLIA法復核，相關性分析顯示CMIA與CLIA法結果呈正相關(r=0.588，P<0.001)。見圖1。

圖1 CMIA與CLIA法相關性分析

2.3TP-WB確認結果抗體表達 40例TP-WB確認結果顯示判讀8例陽性結果，抗體表達為2個條帶并著色強度低；32例判讀可疑陽性結果，抗體表達單一且著色強度明顯降低。見表2。

3 討 論

近年來，梅毒在我國的感染率呈逐年上升趨勢[9]，對我國的公共衛生事業有很大影響[10]，國家衛生行政部門越來越重視，患者本身意識越來越高。然而在臨床工作中，實驗方法存在差異性。文獻報道，對于TP特異性抗體篩查陽性而甲苯胺紅不加熱血清試驗檢測陰性的老年患者需進行TP-WB

表2 40例標本免疫印跡檢測結果不一致的匯總 (例)

CMIA：化學發光微粒子免疫分析法；CLIA：化學發光免疫分析；TPPA：梅毒螺旋體顆粒凝集試驗；TP-WB：梅毒螺旋體免疫印跡試驗；TP：梅毒螺旋體；-∶陰性；+∶陽性；±∶可疑陽性

確證檢測并結合臨床癥狀、體征和病史，做出最后診斷[11-12]。研究發現，TP感染會導致機體產生兩類抗體：一類為抗TP的特異性抗體，是宿主針對TP多種膜蛋白或軸絲抗原等成分產生；另一類為非特異性血清反應素抗體，即抗心磷脂抗體，在TP感染過程中抗心磷脂抗體表達增加，隨著治療的進行其水平會降低，臨床常用血清學方法檢測抗心磷脂抗體滴度反映梅毒疾病活動性[13]。梅毒抗體無免疫保護作用，在臨床上僅用于梅毒血清學的診斷[13]。TP感染機體后，宿主最早產生的抗體是IgM，然后是IgG和IgA。由于IgM變化比較明顯，故臨床常將其作為梅毒血清學診斷的標志物[14]；IgG抗體是體液免疫應答產生的主要抗體，在二期梅毒中表達最強烈，是血清和細胞外液中最主要的抗體成分[15]。人體感染TP 4～10周后，血清中會產生非TP抗體，即抗心磷脂抗體，其產生機制尚不清楚，一般認為是因為細胞受到損傷，線粒體釋放心磷脂，作為抗原刺激機體免疫系統產生相應抗體；也有學者認為是因為TP本身具有心磷脂，所以引起抗心磷脂抗體的產生[16]。經規范治療后，反應素可以逐漸減至陰性，但梅毒特異性抗體IgG不易消退，甚至終身陽性；未經治療的梅毒患者，反應素會在體內長期存在[17]。研究發現，輔助性T細胞2介導的體液免疫應答是造成梅毒長期潛伏感染的主要原因[18]。梅毒外膜蛋白是免疫的主要靶點，TP15、TP17、TP45、TP47被認為在梅毒的診治中起重要作用[19]。有研究表明，TP47是含量較高的外膜脂蛋白，具有較強的免疫原性和反應性；TP17可以激活內皮細胞[20]，能刺激機體產生強烈的抗體反應[21]，在TP免疫致病機制中具有重要作用。

但當結果為弱反應性，梅毒實驗方法檢測存在結果不一致時首先要考慮生物學假陽性反應或生理因素的影響。梅毒血清學檢測生物學假陽性見于自身免疫性疾病、病毒性感染性疾病、心血管性疾病、腫瘤、炎癥患者及生理情況孕婦、老年人等。文獻報道，老年人群出現生物學假陽性的原因可能為隨著年齡的增加，生理功能退化，基礎疾病增多，機體產生了自身抗體、抗類脂抗體或異常蛋白，也可能存在其他螺旋體亞型的感染，使TP抗體檢測出現交叉反應，從而產生生物學假陽性[22-27]。張曉紅等[28]研究顯示，97份TPPA檢測陰性血清樣本，TP-WB確證反應性結果占25.8%,TPPA是采用針對TP15、TP45抗體純化的致病性TP抗原，所以TP15、TP45的抗體效價降低或僅有TP17、TP47抗體時，TPPA可能會無法正確得出陽性結果。

本研究回顧性分析130例弱反應性的梅毒患者中，孕婦人群、老年人群、患有基礎疾病特殊人群(年齡集中在45～60歲)等的CMIA、CLIA、TPPA檢測結果不一致，梅毒篩查實驗方法學不同廠家應用抗原成分及人群分布會導致檢測結果的假陽性、假陰性。本研究CMIA與CLIA法的相關性分析表明，兩種方法檢測結果存在高度一致性，同時出現假陽性的可能性較高。因此，即使兩種方法結果均呈現較高的陽性值時也需采用特異性和穩定性更好地方法進行確證。目前，梅毒檢測中大部分實驗室以TPPA進行補充復核，但易導致臨床診斷的誤診或漏診。本研究結果顯示，以TP-WB檢測方法確證，陽性結果抗體表達為2個條帶并著色強度低，可疑結果中抗體表達單一著色強度明顯降低；TPPA陰性人群中TP-WB抗原帶顯示僅為一個條帶，著色強度在檢測的線性范圍下限。

綜上所述，臨床主要通過檢測患者血清學特異性抗體和非特異性抗體水平作為梅毒診斷及預后評估的實驗室檢測方法。免疫印跡檢測TPN15、TPN17、TPN45、TPN47抗體在弱反應人群梅毒血清檢測結果中以可疑陽性多見，故梅毒實驗室臨床確證在臨床診斷中對于弱反應人群尤為重要。