室內空氣污染對哮喘兒童血清miR-155水平的影響

王詩敏，孫素靜，紀一倫

1.西安市第四醫院兒科，西安 710000 2.西安市第四醫院兒童保健科，西安 710000

哮喘是兒童常見的疾病，全球目前約有2.35億哮喘患者，350萬兒童至少有1次哮喘發作[1-2]。為了有效地治療哮喘，探究其病因及發病的分子機制十分重要。環境因素在哮喘發作風險中起重要作用，如空氣污染[3]。空氣污染可導致肺功能降低、咳嗽、鼻部疾病、哮喘發作、鼻黏膜炎癥和皮疹等，所有這些都可能與哮喘有關。雖然與交通相關的空氣污染可加重呼吸系統疾病，并誘導現有哮喘發作。但是，兒童在室內的時間更多，因此研究室內空氣污染對其哮喘發作的影響至關重要[4]。

暴露在空氣中的污染物，如CO、NO2、SO2、PM10和PM2.5在哮喘發作中起重要作用[5]。miR-155是研究最多的miRNA之一，與復雜的細胞活動有關。變態反應常由高活性的CD4+輔助性T細胞2(Th2)引起，而miR-155在調節過敏性哮喘的細胞免疫活性中起重要作用[6]。本研究旨在探討血清miR-155的變化與空氣污染性哮喘的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2017年9月至2019年3月在西安市多家醫院就診的176例哮喘患兒(哮喘組)及進行體檢的176名健康兒童(對照組)進行國際兒童哮喘和過敏研究(the international study of asthma and allergies in childhood，ISAAC)問卷調查。所有受試對象有身份證或戶口本，如漢族、回族等民族信息均可以通過相關證件進行區分。本次研究所有程序均經醫院倫理委員會批準。問卷由兒童的父母或監護人填寫，問卷回收率為100%，所有數據均由本院2名專業醫師進行核實。調查問題包括：過敏史、呼吸道癥狀、家族遺傳信息、生活環境、生活習慣等。哮喘的嚴重程度通過肺功能測試(pulmonary function tests，PFTS)來評估[7]。所有兒童的父母或監護人簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 哮喘納入標準：(1)哮喘和室內空氣污染史同時存在；(2)存在氣流阻塞(連續3 d或3 d以上咳嗽、喘息和呼吸困難，發生2次或2次以上；(3)β受體激動劑吸入后，第1秒用力呼氣容積(FEV1)增加15%；(4)本實驗之前，持續性哮喘至少發生3個月。排除標準：(1)哮喘發生3個月內使用維生素和(或)抗生素進行治療；(2)有嚴重的器官衰竭，嚴重的心臟、腎臟等疾病。

1.3 miR-155檢測 每名受試者抽取5 mL靜脈血，置于含有2%乙二胺四乙酸抗凝劑的一次性試管中，并充分混合，在4℃下以1 500 r/min離心15 min，收集血清，存儲于-80℃。采用RT-PCR法定量檢測血清miR-155。用microRNA分析試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。用5 μL RNA提取液、0.2 μL 100 mmol/L dNTPs、1.5 μL逆轉錄酶(50 U/μL)、2 μL 10×緩沖液、0.2 μL RNA酶抑制劑(20 U/μL)、0.5 μL引物(20 μm，正向引物：5′-GCG GTT AAT GTA ATC GTG AT-3′，反向引物：5′-GTG CGG GCG AGG T-3′)和9.6 μL雙蒸水在20 μL反應體系下進行反應。將預混物在16 ℃下反應30 min，42 ℃反應30 min，90 ℃反應5 min。另外，用12 μL預混物、1.2 μL引物和6.8 μL無RNA的雙蒸水擴增5 μL cDNA溶液(最終共25 μL)。在7500實時PCR系統(美國賽默費希爾科學公司)上進行qPCR，在94 ℃下反應5 min，進行45個循環(共10 s)，在66 ℃下反應45 s。根據ΔΔCT法計算U6 核小RNA(正向引物：5′-CTC GCT CGC AGC CA-3′；反向引物，5′-AAC GCT TCA ATT TGC GT-3′)與miR-155的相對水平。

1.4 室內空氣采集及質量分析 根據中國《室內空氣質量標準》(GB/T1883-2002)進行采樣，采樣點應高出地面1.0～1.5 m，所有門窗在采樣前關閉12 h[8]。根據ISO 10012-1和ISO 14644以及美國聯邦標準209[9]，用手持粒子計數器(美國Lighthouse 3016IAQ)測量室內粒子(PM10、PM2.5和PM1)濃度。

從起居室和臥室采集多個顆粒樣品，采樣率設定為2.83 L/min，家庭成員正常生活期間，從周一至周五19:00至20:00每天采樣1 h。采用大氣采樣器(北京國際環境衛生研究所環境保護研究所)采集甲醛(HCHO)和NO2樣品，采用N-(1-萘基)-乙二胺二氫氯化物分光光度法測定。同時對客廳和臥室的空氣污染物進行測量，測量時間為2個月。

2 結 果

2.1 兩組兒童基本資料的比較 結果(表1)表明：兩組兒童性別構成、年齡、體質指數、民族分布差異無統計學意義。

2.2 兩組兒童血清miR-155水平的比較 從500 μL血清中分離得到總RNA的0.05～0.29 μg/μL。結果(圖1)顯示：哮喘組的血清miR-155水平為((7.61±2.47)μg/μL，大于對照組[3.31±1.24)μg/μL]，差異有統計學意義(P<0.001)。

表1 兩組兒童基本資料的比較 N=176

圖1 兩組兒童血清中miR-155水平

2.3 兩組室內空氣污染物比較 結果(表2)表明：哮喘組室內PM10、PM2.5、PM1、HCHO、NO2濃度均高于對照組(P<0.05)。

表2 兩組室內空氣污染物的比較 N=176；M(P25,P75)

HCHO：甲醛

2.4 兩組哮喘其他危險因素比較 單因素分析(表3)顯示：兩組兒童過敏史、母乳喂養、環境煙草煙霧 (environmental tobacco smoke,ETS)暴露、室內植物比例差異有統計學意義(P<0.05)，鼻炎史無差異。

表3 兩組兒童哮喘相關病史及環境因素比較 N=176，n(%)

ETS：環境煙草煙霧

2.5 兒童哮喘危險因素的logistic多因素回歸分析 將上述有差異的危險因素納入logistic多因素回歸分析，結果(表4)顯示：兒童過敏史、母乳喂養、ETS、PM2.5、HCHO與哮喘發作相關(P<0.05)，其中母乳喂養對兒童哮喘有保護作用。

表4 兒童哮喘危險因素的logistic多因素回歸分析 N=176

ETS：環境煙草煙霧；HCHO：甲醛

2.6 血清miR-155水平與兒童哮喘危險因素的相關性分析 結果(表5)顯示：哮喘組血清miR-155水平與兒童過敏史、母乳喂養、ETS、PM2.5、HCHO均相關(P<0.05)；對照組無此相關性。

表5 血清miR-155水平與兒童哮喘因素的相關性 N=176

ETS：環境煙草煙霧；HCHO：甲醛

3 討 論

空氣污染物加重了兒童哮喘癥狀的嚴重程度。空氣污染中的顆粒物與兒童呼出的高濃度NO2有關；柴油廢氣顆粒和汽車排放的NO2會降低兒童血液的酸堿度，而較低的酸堿度可引起氣道炎癥[10]。研究[11]報道，肺泡液中較低的酸堿度和較高水平的表皮生長因子可導致哮喘患者發生全身炎癥。多環芳烴是大氣污染的主要成分，超過30%的多環芳烴可被人體吸入[12]。多環芳烴能破壞抗氧化防御系統，間接導致兒童哮喘的發作。此外，控制空氣污染引起的氧化應激和防止呼吸器官損傷可減少兒童哮喘的發作。

本研究顯示，西安市哮喘兒童家庭室內PM10、PM2.5、PM1、HCHO和NO2均較高，可能與汽車尾氣排放和工業發展有關。在中國，烹飪和吸煙是與室內PM2.5的主要來源。其中，使用煤炭的家庭室內顆粒物比較高，而使用燃氣或電做飯可使PM2.5降低40%～70%[13]。PM2.5常在公共室內場所(如吸煙休息室)被檢測到，主要含有苯并芘、多環芳烴和鄰苯二甲酸酯等[14]。一般認為，室內吸煙、烹飪、ETS和家庭裝飾增加了室內顆粒物的濃度，使兒童哮喘的發生風險增加。

本研究logistic多因素回歸分析顯示，室內PM2.5暴露是兒童哮喘發生的獨立危險因素(P<0.05)。HCHO是主要的室內空氣污染物之一，具有強烈的刺激性氣味。本研究表明，HCHO也是兒童哮喘發生的獨立危險因素(P<0.05)。母乳含有大量的IgA、細胞因子、長鏈脂肪酸和低聚糖等物質，可以改善嬰兒的免疫狀態[15]。本研究發現，母乳喂養是避免兒童哮喘發作的一個保護因素(P<0.05)。

miR-155在哺乳動物呼吸系統中表達較廣泛，是通過降低Th2來調節炎癥活性的潛在治療靶點，且在哮喘進展中起重要作用[6]。microRNA檢測是診斷小兒哮喘的一種簡單、無創的方法。本研究發現，miR-155可能與兒童哮喘的風險增加有關。本研究為兒童哮喘的基因治療和環境因素控制提供了理論依據，但還需要進一步的工作來證實。

本研究存在的局限性：未能分析miR-155與兒童哮喘關系的相關分子機制；同時未能分析空氣污染通過影響血清miR-155水平誘發哮喘的分子機制；未分析室內污染物產生的原因。與吸煙相比，烹飪可能是增加室內顆粒物的主要因素。今后還需要進一步的研究來深入探討上述問題。

綜上所述，室內空氣污染與西安市兒童哮喘的發生有關，并使其血清miR-155水平升高；哮喘患兒血清miR-155水平與室內PM2.5和HCHO水平密切相關。因此，血清miR-155水平可能成為判斷哮喘的潛在指標。