全自動微柱凝膠法用于直接抗人球蛋白試驗初篩的臨床觀察

顧晨晨，曹敏鳳，戎瑞明，吳擘颋

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院輸血科，上海 200032

直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin test,DAT)主要用于檢測紅細(xì)胞上結(jié)合的不完全抗體，在自身免疫性溶血性貧血、免疫性溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病等疾病中具有重要診斷價值，但傳統(tǒng)的試管法DAT完全依賴手工操作，且需要檢測人員具有一定的判讀結(jié)果經(jīng)驗，并不適合用于大批量臨床標(biāo)本檢測[1-2]。近年來日益成熟的微柱凝膠法與傳統(tǒng)試管法相比具有標(biāo)準(zhǔn)化、操作簡便、結(jié)果清晰、敏感性高等優(yōu)點，且可實現(xiàn)全自動化檢測[3-5]。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院輸血科自2016年開始采用全自動微柱凝膠法用于臨床標(biāo)本的DAT初篩，顯著提高了報告速度和一致性，但也發(fā)現(xiàn)部分全自動微柱凝膠法初篩陽性標(biāo)本可能受臨床因素干擾而致假陽性。為進一步評估全自動微柱凝膠法用于臨床標(biāo)本DAT初篩的價值和報告注意事項，本研究對我院1 205例DAT結(jié)果進行了總結(jié)，并分析了與全自動微柱凝膠法假陽性有關(guān)的臨床因素，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年12月至2017年11月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院輸血科進行DAT檢測的住院患者資料1 205例。

1.2 DAT檢測 使用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管送檢的患者外周全血標(biāo)本，采用全自動微柱凝膠法(IH-1000全自動血型分析儀，Biorad，美國)進行DAT初篩。微柱凝膠法低離子抗人球蛋白卡(ID-Card LISS/Coombs)由美國Biorad公司提供。陽性者采用試管法進行復(fù)檢和分型。試管法直接抗人球蛋白試驗操作參見《輸血技術(shù)學(xué)》[6]。用于試管法的單克隆抗人球蛋白試劑(多特異性、抗-IgG、抗-C3d)由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供。

2 結(jié) 果

2.1 住院患者DAT檢測陽性率及反應(yīng)強度 2016年12月至2017年11月共進行DAT檢測1 205例，全自動微柱凝膠法初篩陽性180例(14.9%)，其中6例(3.3%)、23例(12.8%)、41例(22.8%)、+ 95例(52.8%)、+/- 15例(8.3%)。陽性標(biāo)本采用試管法復(fù)檢陰性18例(10.0%)，其中13例初篩結(jié)果為+，其余5例為+/-，詳見圖1。

圖1 全自動微柱凝膠法DAT初篩陽性標(biāo)本反應(yīng)強度分布及相應(yīng)假陰性比例

2.2 全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性患者臨床特征 結(jié)果(表1)顯示，全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性患者主要來自于血液科(12例)，其余包括風(fēng)濕免疫科(2例)、感染病科(2例)、消化科(1例)及急診科(1例)，其中淋巴造血系統(tǒng)腫瘤患者12例、自身免疫性疾病患者5例、病毒感染患者1例。患者中位年齡63.0(21～90)歲，男性女性各9例，血紅蛋白中位值86.5(43～117)g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞比值1.85(0.6～4.0)%，均未見明顯溶血征象。

實驗室檢查發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞升高4例(例8、例9、例11、例16)；血清總球蛋白升高7例(例2、例3、例9、例12、例13、例14、例16)，其中1例(例12)血清

表1 全自動微柱凝膠法直接抗人球蛋白試驗假陽性患者臨床特征

所有患者試管法抗人球蛋白試驗及分型陰性、抗體篩選陰性，近期輸血史和生物制劑應(yīng)用史均為檢測前30天內(nèi)。ND：未查。單采血小板1袋：血液成分單采機采集來自一個獻血者的血小板，含有的血小板數(shù)量至少在2.5×1011以上

IgG未見升高但有近期輸注靜脈丙種球蛋白史，其余6例均為血清IgG升高(1例干燥綜合征患者血清免疫固定電泳提示IgG-κ單克隆球蛋白)；另有2例(例7、例8)血清總球蛋白未見升高但檢出IgG-κ單克隆球蛋白，1例(例1)血清總球蛋白未見升高但血清IgM升高。

在DAT檢測前30 d內(nèi)，5例患者接受過輸血治療，其中3例(例9、例10、例17)輸注懸浮紅細(xì)胞、4例(例5、例9、例10、例12)輸注單采血小板；3例患者接受過生物制劑治療，其中2例(例6、例8)使用了利妥昔單抗、1例(例12)使用了靜脈丙種球蛋白。

3 討 論

作為建立于20世紀(jì)40年代的經(jīng)典免疫血液學(xué)實驗方法，目前DAT仍然是臨床診斷紅細(xì)胞免疫相關(guān)疾病時最重要的實驗室檢查，其技術(shù)核心是對紅細(xì)胞膜上所結(jié)合免疫球蛋白的檢出，傳統(tǒng)試管法DAT陽性至少需要每個紅細(xì)胞上結(jié)合150～500個IgG分子[1,7]。近年來隨著免疫血液學(xué)技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了基于微柱凝膠技術(shù)、固相技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)等改良DAT檢測方法，作為傳統(tǒng)試管法DAT的補充，一方面可以提高DAT檢測的敏感性，另一方面有利于將DAT檢測自動化[8]。本研究采用全自動微柱凝膠法用于臨床標(biāo)本的DAT初篩，在1 205例住院患者中總體陽性率為14.9%，其中弱陽性(+及+/-)占61.1%，而所有后續(xù)試管法復(fù)檢陰性者(18例)均來自于弱陽性患者，分別占初篩+及+/-總數(shù)的13.7%(13/95)和33.3%(5/15)，其臨床資料均未提示溶血征象，考慮全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性可能大，此結(jié)果也符合既往文獻報道DAT反應(yīng)強度是診斷自身免疫性溶血性貧血的最重要指標(biāo)之一[8-9]，DAT弱陽性(反應(yīng)強度以下)時非特異性病因相對較多。

臨床標(biāo)本DAT陽性的機制主要包括紅細(xì)胞膜上免疫球蛋白/補體致敏、免疫球蛋白非特異性吸附以及致敏紅細(xì)胞清除速率降低等[10-13]。臨床上導(dǎo)致DAT假陽性最常見的原因是免疫球蛋白非特異性吸附，多見于淋巴造血系統(tǒng)腫瘤產(chǎn)生單克隆或寡克隆增高的球蛋白，以及自身免疫性疾病或感染性疾病過程中產(chǎn)生多克隆增高的球蛋白[10-11]，本研究在18例DAT假陽性患者中發(fā)現(xiàn)10例存在不同程度的球蛋白升高或異常球蛋白，提示免疫球蛋白非特異性吸附在全自動微柱凝膠法DAT檢測中仍是假陽性的主要原因。此外由于全自動檢測時簡化了紅細(xì)胞洗滌過程，臨床標(biāo)本中過高的白細(xì)胞數(shù)也可能干擾受檢紅細(xì)胞在凝膠毛細(xì)管中的離心沉降過程，從而導(dǎo)致DAT假陽性。血液循環(huán)中被免疫球蛋白致敏但未持續(xù)活化補體的紅細(xì)胞通常經(jīng)由單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除，某些病理狀況可造成單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能異常，如高免疫球蛋白血癥時巨噬細(xì)胞表面Fc受體飽和、系統(tǒng)性紅斑狼瘡中巨噬細(xì)胞吞噬功能下降等，進而導(dǎo)致生理狀況下應(yīng)被清除的紅細(xì)胞仍存留于循環(huán)中，在使用更為敏感的微柱凝膠法時易引起DAT弱陽性[12-13]。

全自動微柱凝膠法DAT檢測受標(biāo)本前處理因素影響小、檢驗過程標(biāo)準(zhǔn)化、結(jié)果清晰可保存，很大程度上避免了傳統(tǒng)試管法DAT檢測過程中手工操作和結(jié)果判讀過程中可能產(chǎn)生的誤差，能夠滿足各級別醫(yī)療機構(gòu)臨床標(biāo)本初篩的要求，但臨床部門需注意避免在多次輸血或應(yīng)用特殊生物制劑后短期內(nèi)送檢，以減少DAT檢測結(jié)果解釋困難、需要重復(fù)送檢的情況。本研究進一步指出，全自動微柱凝膠法DAT可能存在的假陽性集中于弱陽性標(biāo)本中，大部分可以發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白異常、白細(xì)胞升高等明確干擾檢測的因素。但也有小部分假陽性結(jié)果可能反映了疾病相關(guān)的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能異常，被免疫球蛋白致敏但未被及時清除的紅細(xì)胞容易被敏感的方法檢測得到，值得擴大標(biāo)本量進一步研究。